人胚胎皮肤成纤维细胞的分离培养与人——牛卵母细胞异质克隆胚构建

摘要

本研究在37C、5％的CO<,2>、饱和湿度下采用组织块体外培养法建立人胎儿皮肤成纤维细胞系，绘制TF8、F12和F44代细胞生长曲线，并对F8、F12及F44代细胞进行核型分析，发现86.9％、84.3％和77.8％的细胞染色体核型保持正常的倍数(2n=46)。对比了培养液不同pH值对成纤维细胞生长状况的影响(取左耳边缘第四代细胞)，当pH值为6.8-7.0时，细胞贴壁率为92.20％；当pH值为7.O-7.2时，细胞贴壁率为79.3％，说明pH值对成纤维细胞生长状况的影响显著(P<0.05)。对比了第四代不同部位(背部2块、肋部2块及双耳边缘)成纤维细胞生长状况，发现不同部位成纤维细胞生长状况差异不显著(P>0.05)。 对比了不同采集方法，不同体积培养液，不同水质对牛卵母细胞经体外成熟培养后的成熟率及孤雌激活囊胚率，发现不同采集方法与不同体积培养液均无显著影响(P>0.05)，两种不同水质对牛卵巢卵母细胞成熟率和卵裂率无显著影响(P>0.05)，但对孤雌胚后期发育影响显著(P<0.05)。 利用人胚胎成纤维细胞作为供体，体外成熟培养18h和19h的牛卵母细胞为核移植受体，构建人-牛重构胚。发现在重构胚的融合率、卵裂率及桑椹胚的获得率上都无显著差距(P>0.05)，但成熟18小时的卵母细胞较适于盲吸法。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词

声明

1引言

2综述

2.1哺乳动物克隆的研究进展

2.1.1克隆的由来

2.1.2胚胎分割的发展史

2.1.3细胞核移植的发展史

2.1.4动物克隆的现状

2.2核移植的方法

2.2.1供体细胞的准备和选择

2.2.2受体的准备

2.2.3核移植的基本步骤

2.3核移植过程中机理的研究

2.3.1核质互作

2.3.2核重建

2.4异种动物核移植

2.4.1异种动物核移植的发展现状

2.4.2异种体细胞核移植的可行性

2.4.3杂合胚胎应用的问题与希望

2.4.4提高异种克隆效率尚待解决的问题

2.4.5异种核移植的应用前景

2.5关于生殖性克隆和治疗性克隆

2.5.1生殖性克隆

2.5.2治疗性克隆

2.5.3治疗性克隆的前景

2.5.4伦理

3实验研究

3.1材料与方法

3.1.1人胚胎成纤维细胞的培养

3.1.2牛卵巢卵母细胞的体外成熟

3.1.3人-牛异质克隆胚的构建

4实验结果

4.1人胚胎成纤维细胞体外原代培养的特点

4.2人胚胎成纤维细胞体外传代培养的特点

4.3不同采集方法对牛卵巢卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚发育的影响

4.4不同体积的培养液对牛卵巢卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚发育的影响

4.5水质对牛卵巢卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚发育的影响

4.6不同成熟时间对牛卵巢卵母细胞体外成熟率及人--牛异质克隆胚体外发育的 影响

4.7不同性别供体细胞对核移植效率的影响

4.8不同代次成纤维细胞对核移植效率的影响

5讨论

5.1人胚胎成纤维细胞体外原代培养的特点

5.2人胚胎成纤维细胞体外传代培养的特点

5.3培养液不同pH值对成纤维细胞生长状况的影响

5.4不同采集方法对牛卵巢卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚发育的影响

5.5不同体积的培养液对牛卵巢卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚发育的影响

5.6水质对牛卵巢卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚发育的影响

5.7不同成熟时间对牛卵巢卵母细胞体外成熟率及人--牛异质克隆胚体外发育的 影响

5.8不同性别供体细胞对核移植效率的影响

5.9不同代成纤维细胞对核移植效率的影响

6结论

致谢

参考文献

主要仪器与试剂

插图和附表清单附图

作者简介