红曲霉遗传转化方法研究及色素、桔霉素的研究

摘要

红曲霉的应用在我国有着悠久的历史。如今，红曲产品广泛地应用在酿酒、食品色素及保健药品等领域。其中，对红曲霉在医药保健方面的应用的研究近年来已成为国内外学者的研究热点。但在1995年，红曲霉中的一种有害代谢产物——桔霉素的发现引起了国内外学者的广泛关注。在欧美各国，桔霉素是食品或饲料中严加控制的毒素之一。 为敲除红曲桔霉素合成酶编码基因，构建不产桔霉素的红曲霉种打下基础，本课题对红曲霉原生质体的制备方法及红曲霉9903A的REMI原生质体转化方法进行了较为详细的研究。重点考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上32℃培养50-60h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为：0.4％lysing enzyme、0.8％cellulase和0.6％snailase的酶组合，31℃作用1.5h；最适渗透压稳定剂是：1mol/L山梨醇。最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol/L蔗糖的RM2培养基。通过原生质体制备方法的研究，可显著提高原生质体的再生率。 本文利用PCR方法从红曲霉9903A菌株染色体扩增出包括ITS1、ITS2的部分序列和5.8S rDNA完整序列的保守系列，通过序列测定及比对分析确认该菌种为紫色红曲霉。用质粒pBC-Hygro进行原生质体转化。转化试验表明，所建立的转化方法可达到将外源基因转化到红曲霉中去的目的。经多次转化在潮霉素B抗性平板上共获得598株转化子，从中挑选色价与原菌株相当和提高的6株转化子进行固态发酵和稳定性的研究。经初筛和复筛，最终获得了色价显著提高的转化子ZM0303。 在进行上述原生质体制备和转化试验的同时，本课题以提高红曲产品色价和降低桔霉素含量为目标，对红曲霉的培养基和发酵条件的优化进行了大量探索性研究。通过单因素试验和正交试验确定了红曲霉固态发酵的培养基组成。还发现在培养基中添加适量硫酸镁、辛酸可以提高发酵液的色价并同时降低桔霉素的含量。在固态发酵工艺方面还研究了培养温度，发现在一定温度范围内(30-36℃)红曲米的色价随着温度的上升而增加，温度偏低(30℃)时，红曲米桔霉素含量显著减少。培养过程中较低的加水量有利于红曲霉产色素。最优的固态发酵条件是种子发酵液R3及pH3.5，大米60g，接种量为45％，大米中添加ZnSO<,4> 0.2％、辛酸0.05％，固态米中加入水pH4.0。在优化条件及初始条件下对转化菌株ZM0303进行固态发酵，在整个发酵过程中，ZM0303的色价稳定提高246.3％，色价与桔霉素含量比值提高了348.12％。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1引言

1.1红曲霉概述

1.1.1红曲简史

1.1.2红曲霉的分类

1.1.3红曲霉的特征

1.1.4红曲霉生理活性物质

1.2红曲色素概述

1.2.1红曲色素的种类及结构

1.2.2红曲色素生产状况

1.2.3红曲色素应用

1.3红曲桔霉素概述

1.3.1红曲桔霉素的发现及毒性研究

1.3.2国内外红曲桔霉素的研究状况

1.4红曲霉遗传转化方法研究进展

1.4.1聚酮体合成酶种类

1.4.2经典的菌种诱变选育技术筛选低产或不产桔霉素的红曲菌种(株)

1.4.3通过发酵工艺条件控制桔霉素的产生

1.4.4利用基因工程技术，构建不产桔霉素的红曲菌种(株)

1.5立题意义

1.6论文主要研究内容

2红曲霉原生质体制备与再生

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2试验方法

2.2试验结果与讨论

2.2.1不同的裂解酶及浓度对原生质体形成的影响

2.2.2菌龄对原生质体形成的影响

2.2.3酶浓度、酶解时间和温度对原生质体形成的影响

2.2.4稳渗剂的种类和浓度对原生质体形成的影响

2.2.5原生质体再生培养基的选择

2.2.6原生质体释放的形态观察

2.3讨论

2.4小节

3红曲霉9903A转化系统及对稳定转化菌株的初步研究

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验方法

3.2试验结果

3.2.1潮霉素B对红曲霉9903A生长的抑制作用

3.2.2影响红曲霉9903A原生质体转化的因素

3.3小结

4桔霉素合成酶基因插入法重组载体的构建及转化的初步研究

4.1材料与方法

4.1.1试验材料

4.1.2试验方法

4.2试验结果与讨论

4.2.1红曲霉9903A保守序列的分子生物学鉴定

4.3小结

5红曲霉9903A固态发酵工艺优化

5.1材料与方法

5.1.1试验材料

5.1.2试验方法

5.2试验结果与讨论

5.2.1种子培养基不同碳源的选择

5.2.2种子培养基不同氮源的选择

5.2.3固态发酵不同接种量对色价的影响

5.2.4固态培养基初始加水量对红曲霉9903A色价的影响

5.2.5大米与小米选择不同比例时对色价的影响

5.2.6拌料水初始pH值对其色价的影响

5.2.7不同的装样量对发酵色价的影响

5.2.8高产色素培养基正交优化试验

5.2.9发酵进程曲线

5.3小结

6红曲霉9903A固态发酵桔霉素控制

6.1材料与方法

6.1.1试验材料

6.1.2试验方法

6.2试验结果与讨论

6.2.1红曲霉9903A三角瓶固态发酵过程中色价和桔霉素的变化规律

6.2.2红曲霉9903A固态小型发酵罐发酵色价和桔霉素的变化规律

6.2.3不同温度对红曲米色素和桔霉素含量的影响

6.2.4镁离子对红曲霉产色素和桔霉素的影响

6.2.5辛酸对红曲霉9903A的影响

6.3小结

7结论与展望

7.1本文主要结论与讨论

7.2展望

致谢

参考文献

附录

作者简介