成年绒山羊皮肤干细胞的分离、纯化、鉴定与诱导

摘要

本研究旨在建立绒山羊皮肤干细胞的分离、纯化培养体系，并对其特性和分化潜能进行进一步探讨，以便为今后利用皮肤干细胞进行绒山羊毛囊的定向调控提供科学的理论依据。 选择健康成年绒山羊背部皮样，经中性蛋白酶4℃消化过夜，分离表皮和毛囊，用胰酶消化后解离细胞，再用Ⅳ型胶原粘附法对消化细胞进行筛选分离，经Ⅳ型胶原粘附10min的绒山羊皮肤干细胞直径较小，核质比较大，培养过程中能够形成鸟巢状、岛状和铺路石状等不同形状的细胞克隆，而且在传代的过程中，大多数细胞始终维持在G1/G0期，各代克隆形成率也比较高，部分细胞表达K15、K19、p63、CD34和β1-hategrin，这些结果表明Ⅳ型胶原粘附筛选的细胞中包含有干细胞。 在此基础上，进一步选择生长状态良好的Ⅳ型胶原粘附后的第二代皮肤细胞作为克隆纯化的对象细胞，利用96孔板有限稀释法获得了形态较为原始，直径约为10μm的单细胞，经传代培养，该细胞能够形成典型的全克隆；而且，随传代次数增加，大多数细胞仍处于G1/G0期，保持着干细胞的慢周期性，有较高的克隆形成率，始终具有较大的增殖潜能和克隆遗传力：各代细胞冷冻复苏率与24小时贴壁率差异不显著(p<0.05)；大多数细胞的K15、K19、p63、CD34和β1-integrin等表面标志鉴定结果均呈阳性，分化标志K10和Involucrin检测结果呈阴性。在体外诱导实验中，这些纯化的干细胞能够被诱导生成神经元、神经胶质细胞、心肌细胞和成骨细胞，具有跨胚层分化潜能。以上结果充分证明了纯化的细胞就是绒山羊皮肤干细胞． 此外，通过β<,1>-integfin和CD34的FISH初步定位了绒山羊皮肤干细胞。其中，β<,1>-integrin主要表达于绒山羊皮肤毛囊的外根鞘和毛乳头尖部，而CD34则主要表达于毛囊的外根鞘、毛乳头尖部和皮肤的基底层。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语表

声明

1引言

1.1哺乳动物皮肤的组织学结构

1.1.1皮肤结构

1.1.2毛囊的基本结构

1.1.3哺乳动物皮肤的发育

1.2内蒙古绒山羊皮肤及毛囊发育特征

1.2 1内蒙古绒山羊品质特征

1.2.2内蒙古绒山羊皮肤毛囊结构特点

1.2.3内蒙古绒山羊皮肤和毛囊发育

1.3皮肤干细胞的定义及其特性

1.3.1皮肤干细胞的定义

1.3.2皮肤干细胞的特性

1.4皮肤干细胞的分类与定位

1.4.1表皮增殖单位学说

1.4.2隆突激活假说

1.4.3网状嵴分布学说

1.5皮肤干细胞的数量

1.6皮肤干细胞的表面标志

1.7皮肤干细胞的可塑性

1.8皮肤干细胞发育的调控

1.8.1干细胞Niche

1.8.2调控皮肤干细胞的信号通路

1.8.3细胞与其环境之间的相互作用

1.9与皮肤干细胞相关的其他干细胞

1.9.1旁侧干细胞

1.9.2肿瘤干细胞

1.10皮肤干细胞的应用

1.11研究目的与意义

2实验一成年绒山羊皮肤干细胞的分离与体外培养体系的建立

2.1实验材料

2.1.1主要实验仪器及耗材

2.1.2主要试剂

2.1.3抗体

2.2实验方法

2.2.1皮肤干细胞的分离

2.2.2皮肤干细胞培养体系的初步建立

2.2.3皮肤干细胞的传代培养

2.2.4皮肤干细胞的生长曲线测定

2.2.5皮肤干细胞的细胞周期测定

2.2.6皮肤干细胞的冷冻与复苏

2.2.7皮肤干细胞的克隆形成率测定

2.2.8皮肤干细胞的免疫荧光染色

2.2.9皮肤干细胞的荧光原位杂交

2.2.10数据分析

2.3结果与讨论

2.3.1皮肤干细胞的分离与培养

2.3.2细胞生长曲线

2.3.3细胞周期

2.3.4克隆形成率

2.3.5细胞的冷冻与复苏

2.3.6细胞免疫荧光染色

2.3.7荧光原位杂交

2.4 小结

3实验二成年绒山羊皮肤干细胞的纯化(干细胞株的建立)

3.1实验材料

3.1.1实验仪器

3.1.2试剂及耗材

3.2实验方法

3.2.1皮肤干细胞的纯化(皮肤干细胞株的获得)

3.2.2皮肤干细胞株的体外抑制分化培养体系的建立

3.2.3纯化皮肤干细胞的传代培养

3.2.4纯化皮肤干细胞生长曲线的测定

3.2.5纯化皮肤干细胞的细胞周期测定

3.2.6纯化皮肤干细胞的冷冻与复苏

3.2.7纯化皮肤干细胞克隆形成率的测定

3.2.8数据分析

3.3结果与讨论

3.3.1皮肤干细胞的纯化

3.3.2纯化皮肤干细胞的传代培养

3.3.3细胞生长曲线

3.3.4细胞周期

3.3.5细胞的冷冻与复苏

3.3.6克隆形成率

3.4小结

4实验三成年绒山羊皮肤干细胞的鉴定

4.1实验材料

4.1.1实验仪器

4.1.2试剂及耗材

4.1.3抗体

4.2实验方法

4.2.1细胞免疫荧光染色

4.2.2荧光原位杂交

4.2.3数据分析

4.3结果与讨论

4.3.1纯化皮肤干细胞的免疫荧光染色

4.3.2纯化皮肤干细胞的荧光原位杂交

4.3.3纯化皮肤干细胞的分化标志检测

4.4 小结

5实验四成年绒山羊皮肤干细胞的定向诱导分化

5.1实验材料

5.1.1实验仪器及耗材

5.1.2主要试剂

5.1.3抗体

5.2实验方法

5.2.1成年绒山羊纯化皮肤干细胞向神经细胞的诱导分化

5.2.2成年绒山羊纯化皮肤干细胞向心肌细胞的诱导分化

5.2.3成年绒山羊纯化皮肤干细胞向成骨细胞的诱导分化

5.3结果与讨论

5.3.1向神经细胞诱导

5.3.2向心肌细胞诱导

5.3.3向成骨细胞诱导

5.4小结

6实验五成年绒山羊皮肤干细胞的初步定位

6.1实验材料

6.1.1实验仪器

6.1.2实验试剂

6.1.3实验试剂的配置

6.2实验方法

6.2.1石蜡切片的制备

6.2.2 Sapic法染色

6.2.3荧光原位杂交

6.3结果与讨论

6.3.1皮肤切片的Sapic法染色

6.3.2荧光原位杂交

6.4小结

7论文总体结论

8本研究的创新之处

致 谢

参考文献

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