骆驼斯氏副柔线虫病流行病学调查及rDNA-ITS序列分析研究

摘要

斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)是一种主要寄生于骆驼皱胃的寄生性线虫，斯氏副柔线虫病是严重危害各地养驼业的重要寄生虫病之一。为解决目前我国在斯氏副柔线虫传播媒介和副柔属传统分类学上存在的一些问题，本文在流行病学调查、PCR扩增内转录间隔区基因序列分析和基于ITS1和ITS2序列设计特异引物筛选传播媒介三个方面对斯氏副柔线虫进行了初步研究，结果如下： 采用常规寄生虫学剖解技术，对内蒙古几个双峰骆驼主产区的80峰不同品种和不同年龄的骆驼进行了剖解，检查了斯氏副柔线虫感染情况，统计了感染率和感染强度。被检骆驼中58峰为阳性，感染率为72.5％；最大感染强度是1315条/峰。 运用PCR方法，以保守引物NC5、NCl3、NCl3r和NC2扩增了从内蒙古地区骆驼皱胃分离的斯氏副柔线虫rDNA的内转录间隔区ITS、ITS1和ITS2序列。将PCR扩增出的片段纯化后，克隆至pGM-T载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行了测序。结果表明：扩增的ITS、ITS1、ITS2片段大小分别为837bp、372bp和484bp。同Genbank的Blast搜索所得旋尾目下各科间ITS1、5.8S和ITS2序列间的同源性比较，ITS1序列同源性为48.8％～61.7％；5.8S序列同源性在65.6％～100％;ITS2序列同源性为6.8％～74.2％。基于5.8S同源性构建进化树发现同日本霍加披线虫关系较近，其次为柔线科的三个种。 基于ITS通过核苷酸序列筛选得到的特异性区域设计，合成PSp1和PSp2引物，对人工培养获得的斯氏副柔线虫虫卵或幼虫进行特异性扩增可得出约600bp扩增条带。敏感性试验表明，含有5个虫卵的DNA模板应用普通PCR即可扩增出来，同时设立的特异性试验证明，该引物对于疑似媒介的DNA筛选有很好的特异性。 本研究首次报道了骆驼斯氏副柔线虫的ITS序列，为斯氏副柔线虫传播媒介的研究提供了一种新的分子检测技术，同时为分子生物学的进一步研究奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略词语表

声明

一综述部分

1骆驼生存现状

1.1世界骆驼种类与分布

1.2我国双峰驼品种与数量

2骆驼斯氏副柔线虫病

2.1病原种类与形态学

2.2流行病学和生活史

3寄生虫DNA序列系统学分析

3.1基于PCR的分子技术应用

3.2分子系统进化树构建方法

3.3 DNA序列分析相关软件

4 ITS序列在寄生虫分子系统学中的应用

4.1基因间隔序列(ITS)的概念和结构特征

4.2 ITS研究原理与应用方法

4.3 ITS区域的变异性

4.4 ITS引物的设计

4.5 ITS在分子系统学中的应用

4.6 ITS方法在研究中存在的问题和缺陷

5本研究的目的及意义

二试验部分

研究一内蒙古地区骆驼斯氏副柔线虫病流行病学调查

1.1材料与方法

1.2结果

1.3讨论与分析

研究二斯氏副柔线虫rDNA-ITS PCR扩增克隆及序列分析

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

试验三基于rDNA-ITS区域的斯氏副柔线虫特异性引物设计

3.1材料与方法

3.2结果

3.3讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介