异源强毒株HN基因替换对嵌合体新城疫rLaSota病毒致病力影响的研究

摘要

新城疫(Newcastle disease，ND)是危害世界养禽业的重大烈性传染病。由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起，NDV为单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽副黏病毒属(Avulavirus)。NDV基因组全长15kb，其基因组编码的蛋白包括核蛋白(nucleoprotein.NP)，磷蛋白(phosphoprotein，P)，基质蛋白(matrix protein，M)，融合蛋白(fusion proteins，F)，血凝素一神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase，HN)和大聚合酶蛋白(RNA-dependentRNA polymerase or 1arge polymerase，L)六个独立转录编码单元。 人们对新城疫病毒致病性的研究主要集中在F蛋白和HN蛋白的致病力上，认为F蛋白的裂解位点的氨基酸序列是新城疫病毒致病性的主要决定因素。NDV的HN蛋白是一个多功能蛋白，NDV的HN基因在病毒的感染过程中扮演着重要角色，但是HN基因对致病性的确切作用还不十分明确。HN蛋白具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)两种活性。识别细胞表面的唾液酸的受体并促进F蛋白的融合作用。因此，HN蛋白在病毒的感染过程中扮演着重要的角色。 本研究在成功重组新城疫Lasota的基础上，利用反向遗传操作技术，将强毒株F48E9、HB38的HN基因替换rLasota的HN基因。提取F48E9、HB38基因组RNA，利用引物经RT-PCR获得其HN基因的PCR产物。连接pBluscriptⅡKS(+/-)载体多克隆位点上，测序正确后，利用特定的MunI和Spe I酶切位点酶切得HN基因片段。构建全长质粒，进行转染，收获病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN。拯救病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN的F3代，收获病毒阳性尿囊液提取病毒基因组RNA，进行RT-PCR及序列分析。 嵌合病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN在鸡胚内的生长特性与亲本株Lasota一致，与F48E9、HB38的生长特性相差甚远。通过分析是否HN蛋白的来源对于NDV的生物学活性有一定的影响，以及亲本毒株及嵌合病毒红细胞吸附性和融合作用。结果表明：嵌合病毒红细胞吸附性明显增强，rL-F48E9HN、rL-HB38HN分别增加51％、62％，而融合作用无明显变化。嵌合病毒对鸡及鸡胚的致病性研究表明：rL-F48E9HN、rL-HB38HN的MDT分别为148h、120h，ICPI分别为0.43、0.64；IVPI均为0。说明嵌合病毒rL-F48E9HN、rL-HB38HN的致病指标有微弱的增强，但是并没有达到强毒力水平，仍属于弱毒株。结果也表明NDV的致病性是多基因作用的结果，F蛋白的裂解位点并不是NDV毒力的唯一决定因素。

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声明

引言

1新城疫

2新城疫病毒

2.1 NDV生物学特性

2.2 NDV基因组结构及其功能

2.3 NDV结构蛋白及功能

2.3 NDV致病性的分子基础

2.4 NDV病毒的分离与鉴定

2.5新城疫病毒的反向遗传操作系统的发展

3本实验研究的目的及意义

实验部分 1材料与方法

1.1质粒、菌种、细胞和病毒

1.2 SPF鸡和SPF鸡胚

1.3主要试剂与材料

1.4嵌合病毒全长cDNA的构建

1.4.1引物设计与合成

1.4.2 F48E9和HB38病毒RNA提取、反转录及PCR扩增

1.4.3 F48E9和HB38HN基因替换过程

1.5病毒的拯救

1.6拯救病毒的基因序列分析确认

1.7各嵌合病毒在SPF鸡胚的生长特性

1.8红细胞吸附实验

1.9嵌合体病毒融合指数检测

1.10各拯救病毒的致病性试验

1.10.1各嵌合病毒鸡胚平均致死时间(MDT)的测定

1.10.2各嵌合病毒1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)测定

1.10.3各嵌合病毒6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)的测定

1.11交叉免疫保护实验

实验部分 2结果

2.1嵌合病毒获得

2.2嵌合病毒的生长特性

2.3嵌合病毒生物学活性

2.3.1嵌合病的红细胞吸附性(HAd)

2.3.2嵌合病毒的细胞融合活性

2.4嵌合病毒的致病性

2.4.1嵌合病毒的细胞致病性

2.4.2嵌合病毒对鸡胚和雏鸡的致病力测定

2.5交叉免疫保护实验结果

实验部分 3讨论

3.1序列分析

3.2嵌合病毒的分子生物学分析

3.3嵌合病毒的致病性分析

3.4单因子血清交叉免疫保护实验分析

实验部分 4结论

致谢

参考文献

附录

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