拟南芥CBF1、CBF4基因及启动子的克隆与植物表达载体的构建

摘要

植物的生长发育多受到各种环境因子的胁迫，低温和干旱成为主要的逆境胁迫因子。紫花苜蓿是多年生栽培牧草，号称“牧草之王”。它不但营养丰富、适应性广、适口性强而且可以增加土壤肥力，但苜蓿的生长发育也同样受到低温和干旱环境因子的胁迫。因此选育高抗优质的苜蓿品种成为育种工作者亟待解决的问题。 为研究上述基因家族里的其中的两个基因CBF1、CBF4对我国优良豆科牧草——苜蓿的抗寒、抗旱性的改良作用，本论文从拟南芥植物中利用PCR方法分离得到了上述两个基因及CBF1的启动子，并且分别构建了由CaMV35s启动子和来源于拟南芥的CBF1启动子驱动的植物转化表达载体，PBI121—CBF1、PBI—PRO—CBF1、PBI121—CBF4。为下一步研究利用上述两个基因来达到改良苜蓿抗逆性的目的奠定了坚实的基础。 研究获得的初步结果：1、通过PCR方法筛选出能够稳定分离基因CBF1的引物对一：通过PCR方法筛选出能够稳定分离CBF1基因启动子的引物对三；通过PCR方法筛选出能够稳定分离基因CBF4的引物对五。2、通过PCR方法从拟南芥基因组DNA中分离得到冷诱导转录因子CBF1基因、CBF1基因特异性启动子、CBF4基因3、通过基因分离、验证、测序、质粒提取、酶切、回收连接、转化、筛选、电击转化等一系列载体的构建方法构建植物表达载体PBI121—CBF1、PBI—PRO—CBF1、PBI—CBF1—PRO、PBI121—CBF4并通过PCR、酶切等方法验证。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略语表

声明

1引言

1.1苜蓿转基因研究现状

1.1.1提高苜蓿抗非生物胁迫的研究

1.1.2提高苜蓿抗生物胁迫的研究

1.2基因与基因工程研究概况

1.2.1基因研究的发展

1.2.2基因工程的定义及其主要的研究内容

1.2.3基因操作的基本概念和技术原理

1.3 CBF基因家族

1.3.1 CBF基因家族的成员及其发现过程

1.3.2 CBF基因的特点

1.3.3 CBF基因在抗寒和抗旱中的交互作用

1.4 CBF转录因子在植物基因工程研究概况

2目的与意义

3材料和方法

3.1实验材料

3.1.1拟南芥菜简介

3.1.2拟南芥作为一种模式植物的优点

3.1.3大肠杆菌

3.1.4酶以及试剂

3.2主要仪器

3.3常用溶液的配制

3.3.1溶液的配制

3.3.2实验试剂的配制

3.3.3 PCR反应

3.4实验方法

3.4.1质粒DNA的酶切验证

3.4.2 DNA测序

3.4.3从质粒上扩增所需要的片段

3.4.4连接反应体系

3.5主要实验方法：

3.5.1引物的筛选

3.5.2从基因组中克隆目的基因

3.5.3植物表达载体的构建

3.5.4质粒转化农杆菌的电击转化

4结果与分析

4.1引物筛选结果

4.2 CBF1基因片段的克隆及序列分析

4.3 CBF1-PRO启动子片段的克隆及序列分析

4.4 CBF1启动子功能预测分析

4.5 CBF4基因片段的克隆及序列分析

4.6植物表达载体的构建

4.6.1 PBI121-CBF1植物表达载体的构建

4.6.2 PBI-PRO-CBF1植物表达载体的构建

4.6.3 PBI-CBF1-PRO植物表达载体的构建

4.6.4 PBI121-CBF4植物表达载体的构建

5讨 论

6结 论

7展 望

致 谢

参考文献

附 图

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