小G蛋白在马铃薯防卫反应体系建立过程中调控机理的研究

摘要

小G蛋白是一类单体GTP结合蛋白，具有GTPase活性，分子量介于21～30KD。植物中的小G蛋白由于和动物中Rho具有极高的同源性，因此命名为ROP(Rno-relatedGTPase from plants)家族。目前在拟南芥，玉米，水稻和苜蓿中都克隆到了rop基因。
　　 大量的研究结果表明，Rho-GTP酶调控着许多种细胞生理过程如：细胞的极性发育，内吞作用，H2O2的产生等。马铃薯晚痘病是由于疫霉菌(Phytophthora infestans)侵染而发生的一种病害，它是马铃薯主栽培地区的一种毁灭性的病害。由于目前的马铃薯栽培品种缺乏对马铃薯晚疫病的抗性，而且生理小种的变化也使得品种抗性和化学防治的方法失去了其应有的优势，分子抗病育种便成为了当前防治此病的一种主要的途径。本研究将拟南芥基因AtRop1与GFP融合，在强启动子CaMV 35S驱动下于马铃薯中过量表达，检测转基因马铃薯对晚疫病菌的广谱抗性，从而建立ROP-GTP酶在马铃薯防卫体系建立的信号转导途径中的调控机制，进一步完善马铃薯抗病机理的研究。
　　 首先，我们对马铃薯品种紫花白和夏坡蒂两个品种在活体与离体条件下防御酶系(CAT、POD和SOD)的变化趋势进行了比较，结果表明在0-4天内CAT、POD和SOD的活性变化趋势趋于一致。因此，在今后的研究中可以利用马铃薯的离体叶片作为接种材料来间接的反映马铃薯植株活体叶片的ROS清除酶系的活性变化。
　　 在马铃薯叶片再生体系的研究中，我们优化了6种马铃薯品种在不同激素浓度下的愈伤诱导率和不定芽分化率，结果表明不同马铃薯品种愈伤诱导培养基存在差异，在愈伤组织生长最适培养基中的诱导率分别为大西洋100％；费乌瑞它95．83％：夏坡蒂96,96％；紫花白100％：底西瑞100％和虎头83.87％。通过6-BA、NAA、ZT和GA3的不同浓度组合诱导不定芽的分化，结果显示不同品种间不定芽分化的最佳培养基组合有差异，大西洋、费乌瑞它、夏坡蒂、紫花白、底西瑞和虎头的最高分化率分别为18.18％，13.04％，17.86％，15．00％，44.44％和47.83％。
　　 将拟南芥基因AtRop1和GFP与组成型启动子CaMV 35S融合，构建植物遗传转化载体，通过酶切与测序，确定AtRop1和GFP已经插入到表达载体中；然后通过冻融法将表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中，提取质粒经PCR检测证明表达载体己导入农杆菌中。
　　 通过研究农杆菌介导的瞬时表达，我们发现接种晚疫病菌Phytophthoara infestans后，失活型DN-ROP1瞬时表达位点产生的病斑面积较小；DAB染色结果表明此位点中积累了较多的H2O2；在表达DN-ROP1的位点的叶片附近菌丝的生长也受到不同程度的抑制，表明拟南芥的AtROP1在马铃薯防卫体系中起到一定作用。
　　 为了得到稳定表达的转基因马铃薯株系，我们利用农杆菌将p1300-GDR转入夏坡蒂中，获得抗潮霉素的抗性植株。经PCR、PCR—Soothern和斑点印迹检验，证明DN-Rop1和GFP已整合到马铃薯基因组中。对转基因DN-Rop1马铃薯株系接种晚疫病菌(Phytophthoara infestans)，DAB染色后发现在接种48和72小时后，和对照相比较，H2O2在转基因马铃薯叶片中有较多的积累；利用标准曲线，将接种不同时间后H2O2的积累量进行定量，结果发现在转基因DN-Rop1马铃薯中H2O2量要高于对照组。同时，在转基因DN-Rop1马铃薯中叶片上菌丝生长量受到抑制。
　　 利用已克隆小G蛋白的保守区设计简并引物，采用RT-PCR结合3’，5’Race在马铃薯叶片中克隆了马铃薯小G蛋白StRac1。StRac1的cDNAJe序列包含有633个碱基，其功能域和拟南芥中克隆到的小G蛋白高度保守。通过进化树分析，发现马铃薯StRAC1与拟南芥中的AtROP10和AtROP11遗传距离最近，属于第IV类；通过和已知的植物中克隆到的小G蛋白的氨基酸的同源性分析，发现马铃薯StRAC1与烟草NtRAC4的氨基酸序列同源性最高，达到99％。利用RT-PCR，我们发现马铃薯内源小G蛋白StRAC1在不同组织中的表达量有差异，茎中表达量最高，老叶最低。将StRac1与GFP融合，构建遗传表达，并成功转入农杆菌LB4404中，随后将对马铃薯进行遗传转化并期望获得转基因植株用于抗性分析。

目录

1前言

2马铃薯活体与离体叶片中防御酶系活性变化的比较

3马铃薯不同品种叶片再生体系的研究

4植物表达载体的构建及AtROP1在马铃薯中功能的初步研究

5农杆菌转化马铃薯及转基因植株的分子鉴定

6拟南芥AtRop1基因在马铃薯中的功能研究

7马铃薯中小G蛋白StRao1的表达及其表达载体的构建

全文讨论

结论

致谢

参考文献

作者简介

论文说明：缩略词

声明