饲喂肉牛抗菌药对牛源大肠杆菌Ⅰ型整合子相关的耐药性影响的研究

摘要

抗菌药促生长剂在畜牧业生产中的大量使用促进了动物源耐药菌的产生和传播，并且这些耐药菌株可通过食物链传递给人。目前，由此引发的细菌耐药性的蔓延已经成为一个全球性关注的公共卫生问题，这给畜牧业发展和人类健康带来极大的潜在威胁。为了检测饲喂肉牛抗菌药添加剂对牛源大肠杆菌与Ⅰ型整合子相关的耐药性的影响，本研究对从饲喂金霉素(A44)或金霉素和磺胺甲嘧啶混合物(AS700)以及没有饲喂任何抗菌药(对照组)的肉牛分离的204株耐四环素大肠杆菌(对照组，n=111；A44组，n=40；AS700组，n=53)进行了对11种常用抗菌药物的药敏检测分析，并利用PCR技术、酶切图谱分析和直接测序法对从饲喂不同处理组肉牛分离的大肠杆菌Ⅰ型整合子/基因盒的流行性及所有菌株的种系发生分型进行了调查、分析及鉴定。
　　随后，采用PFGE分子分型技术对36株经上述研究鉴定的携带整合子的大肠杆菌间的亲缘关系和流行相关性进行了研究，并且通过PCR技术检测了与牛源大肠杆菌中所表现的主要耐药表型相关的耐药基因的流行情况，并对这些耐药基因与整合子间的相关性进行了分析。
　　药敏试验结果显示AS700组和A44组大肠杆菌分离株的耐药率整体上而言要高于对照组分离株，其中对氨苄西林、氯霉素、链霉素的耐药率，AS700组和A44组分离株均显著高于(P＜0.01)对照组分离株。不同处理组牛源大肠杆菌中Ⅰ型整合子的流行性检测结果表明，A44组(33％)和AS700(28%)组分离株Ⅰ型整合子携带率要显著高于(P＜0.001)对照组分离株(7%)的携带率。对基因盒进行测序分析显示，本研究分离的牛源大肠杆菌中有8种基因盒流行，主要集中在甲氧苄啶耐药基因家族(dfr)和氨基糖苷类耐药基因家族(aad)上。八种基因盒分别编码了对氨基糖苷类药物(aadA1，aadA2，aadA4，aadA5)，甲氧苄啶(dfrA1，dfrA12，dfrA17)和氯霉素(catB3)的耐药性。其中，基因盒排列 aadA1和dfrA12-orfF-aadA2流行最为广泛，dfrA1-catB3-aadA4为牛源大肠杆菌中首次报道。
　　通过分析牛源大肠杆菌的耐药表型和Ⅰ型整合子的关系发现，菌株是否携带Ⅰ型整合子与其多重耐药水平有密切关系。携带Ⅰ型整合子的菌株绝大部分耐受链霉素、磺胺药、氨苄西林以及氯霉素；而菌株对喹诺酮类、阿莫西林-克拉维酸耐药表型与Ⅰ型整合子及耐药基因盒携带相关性不强。86%的整合子阳性菌株属于大肠杆菌种系发生分型B1组群。携带整合子的大肠杆菌PFGE分子分型结果显示携带同一整合子的菌株在同源和非同源大肠杆菌中都有发现。
　　耐药基因检测结果显示，A44组和AS700组分离株 aadA1、sul1、cat、blaTEM1基因携带率分别要显著高于(P＜0.001)对照组分离株的携带率。耐药基因间的相关性分析结果表明 tet(A)基因与其它耐药基因元件 sul1(r=0.44)、cat(r=0.58)、aadA1(r=0.61)以及intI1(r=0.37)之间为正相关。
　　综上，本研究认为肉牛业生产中抗菌药添加剂的长期使用与牛源大肠杆菌分离株耐药率的升高密切相关，并且饲喂肉牛抗菌药促进了牛源大肠杆菌中Ⅰ型整合子的获得。细菌从亲代向子代的垂直传播和细菌间可移动基因元件的水平传递共同导致了饲养场肉牛分离的大肠杆菌中Ⅰ型整合子的扩散。此外，耐药基因与可移动基因元件(如整合子)的关联促进了耐药性在大肠杆菌间及大肠杆菌与其它肠道细菌间的传播。

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插图和附表清单

1 引言

1.1 抗菌药概述

1.2 抗菌药在肉牛业生产中的应用

1.3 细菌耐药性研究进展

1.4 细菌耐药基因研究

1.5 细菌整合子-基因盒系统研究进展

1.6 大肠杆菌概述

1.7 畜牧业生产中抗菌药的使用对人类食品健康安全的威胁

1.8 本研究目的意义和主要内容

2 研究一：耐四环素大肠杆菌的分离鉴定及耐药性研究

2.1 试验材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

3 研究二：耐四环素大肠杆菌Ⅰ型整合子流行性的检测与基因盒结构分析

3.1 试验材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 研究三：携带Ⅰ型整合子耐四环素大肠杆菌PFGE分子分型研究

4.1 试验材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

5 研究四：耐四环素大肠杆菌中与耐药性相关耐药因子的检测分析

5.1 试验材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

6 结论

7 创新点

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介