辣椒细胞核雄性不育育性相关基因分离克隆及其生物信息学分析

摘要

本研究以沈阳市农业科学院辣椒育种课题组的辣椒雄性不育两用系?AB23?为材料，采用cDNA-AFLP技术，研究辣椒细胞核雄性不育两用系可育株和不育株的花器官发育过程中基因转录组表达差异，并克隆辣椒育性相关基因，对其进行信息学分析，将得到的育性相关基因进行了 RT-PCR验证。主要结果如下：
　　1.分别以可育株群花蕾和不育株群花蕾的cDNA为模板，选用128对 E+2/M+3的选择性扩增引物进行 AFLP分析，得到了21条与辣椒细胞核雄性不育育性相关的TDFs，在 NCBI的公共数据库中经 Blastx或 Blastn在线检索，16条可以找到较高同源性的序列，在其余的5条中，4个在 NCBI中无同源序列，一条功能未知。这5个 TDFs可能代表与辣椒育性相关的新基因；在16个有较高同源性的序列中，可育株群花蕾特异表达的15个，不育株群花蕾特异表达的1个。
　　2.经 Blast比对，CAF01与番茄花药绒毡层特异表达并编码富含甘氨酸蛋白的基因在核苷酸序列上同源性75％；CAF11与拟南芥果胶甲酯酶有76%的同源性；CAF12与拟南芥脂质转移蛋白也有76%的同源性，上述3个基因已被证明与植物的育性建成相关，说明 CAF01、CAF11、CAF12可能是与辣椒育性相关的基因；CAS30与番薯衰老相关蛋白同源性86%，该基因片段在不育株群花蕾中特异表达，说明该基因可能是导致细胞核雄性不育的相关基因；CAF26编码的产物功能未知，CAF02、CAF09、CAF15及 CAS33经 BlastX和Blastn检索没有同源系列，说明可能得到了与辣椒雄配子发育相关的新基因。
　　3.获得的16个功能差异片段，涉及分泌（CAF01）、代谢(CAF05)、转录(CAF21)、细胞程序性死亡(CAS30)、蛋白质修饰(CAF16)、胞间运输(CAF07、CAF12)、信号转导(CAF08)、细胞黏附（CAF03）等多个相关过程。
　　4.为进一步验证 cDNA-AfLP结果的可靠性，对21个特意表达的TDF进行半定量 RT-PCR分析。结果显示，在 AFLP中，CAF01、CAF05、CAF11、CAF21，没有表达，但在 RT-PCR验证中，都出现了弱带，但其表达趋势同 AFLP相一致，可能与 AFLP的染色方法有关，其它基因片段的验证结果与 cDNA-AFLP结果一致。RT-PCR分析结果进一步证明了利用cDNA-AfLP筛选差异基因的可靠性。

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1 引言

1.1 植物的雄性不育

1.2 植物雄性不育分子机理的研究进展

1.3 辣椒雄性不育的研究进展

1.4 cDNA-AFLP 技术及其在雄性不育研究中的应用

1.5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3. 结果与分析

3.1 总 RNA 的纯度和质量检测

3.2 辣椒核雄性不育的 cDNA-AFLP 分析

3.3 RT-PCR 验证

4 讨论

4.1 采样

4.2 cDNA-AFLP 技术结果的可靠性

4.3 育性相关基因分析

4.4 cDNA-AFLP 差异片段的研究展望

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介