大针茅质膜水孔蛋白亚家族PIP基因cDNA序列的克隆及分析

摘要

以大针茅（Stipa grandis P.Smirn）为建群的群落是内蒙古中东部地区重要的草场，具有不可忽视的生态和经济意义，水分是影响大针茅草原植物分布和生长发育的主要限制因子。本研究以大针茅为材料，通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和快速分离 cDNA末端技术（RACE），克隆大针茅质膜水孔蛋白基因（plasma membrance intrinsic protein）全长 cDNA，并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析和结构的预测。目的在于揭示 PIP在大针茅水分利用中的机制奠定基础。主要研究结果如下：
　　根据已公布的同源物种 PIP基因保守区序列设计引物，结合 RACE技术克隆得到1条 SgPIP2和2条 SgPIP1全长 cDNA，分别命名为 SgPIP2-1、SgPIP1-4和SgPIP1-5。SgPIP2-1 cDNA长1066bp，864bp的开放阅读框，编码288个氨基酸。SgPIP1-4 cDNA长1054bp，含有864bp的开放阅读框，编码288个氨基酸。SgPIP1-5 cDNA长1053bp，含有867bp的开放阅读框，编码289个氨基酸。
　　SgPIP2-1、SgPIP1-4和SgPIP1-5与其它同源物种核苷酸序列的Blast比对表明，SgPIP2-1与大麦 HvPIP2-1的进化关系最近为96％；SgPIP1-4与玉米 ZmPIP1-4的同源性最近为83%；SgPIP1-5与大麦 HvPIP1-5的同源性最近为85%。SgPIP2-1、SgPIP1-4和SgPIP1-5推导的氨基酸序列和大针茅 SgPIP1-1、SgPIP1-2、SgPIP1-3、禾本科 PIPs基因家族构建系统进化树，结果表明，SgPIP2-1为 PIP2类基因亚家族成员，SgPIP1-4和SgPIP1-5为 PIP1类基因亚家族成员。
　　氨基酸序列的生物信息学分析表明，SgPIP2-1、SgPIP1-4和SgPIP1-5具有MIP家族的信号序列 SGXHXNPAVT，同时具有质膜水通道蛋白的特征信号序列GGGANXXXXGY和TGI/TNPARSL/FGAAI/VI/VF/YN。疏水/亲水性和跨膜结构域的预测和分析表明，SgPIP2-1、SgPIP1-4和SgPIP1-5为疏水性蛋白，为典型膜蛋白的特征。
　　蛋白质三级结构的预测表明，SgPIP2-1、SgPIP1-4和SgPIP1-5的6个跨膜α-螺旋和5个亲水 Loop环连接，中间有两个嵌入但不贯穿膜的短α-螺旋几乎顶对顶放置。在这两个短α-螺旋相对的顶端各有1个在所有水通道蛋白家族中都保守的Asn-Pro-Ala（NPA）氨基酸单元。

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1 引言

1.1 大针茅植物简介

1.2 水孔蛋白简介

1.3 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 仪器和试剂

2.3 总 RNA 提取

2.4 特异性引物的设计

2.5 反转录 PCR 反应

2.6 SgPIP 中间 cDNA 的克隆

2.7 3′RACE 技术克隆 SgPIP 的 3′末端 cDNA

2.8 5′RACE 技术克隆 SgPIP 的 5′末端 cDNA

2.9 SgPIP 全长 cDNA 的克隆

2.10 生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 总 RNA 的提取及检测

3.2 SgPIP 中间 cDNA 的克隆及分析

3.3 SgPIP 3′末端 cDNA 的克隆及分析

3.4 SgPIP 的 5′末端 cDNA 克隆及分析

3.5 SgPIP 全长 cDNA 的克隆及分析

3.6 SgPIP 的生物信息学分析

4 讨论

4.1 大针茅 SgPIP 的中间 cDNA 的克隆

4.2 大针茅 SgPIP 的 3′和 5′末端 cDNA 克隆

5 结论

致谢

参考文献

作 者 简 介