Rab7基因沉默调控巨噬细胞中TLR4/TLR3信号通路的研究

摘要

Toll样受体家族(Toll-like receptor，TLRs)识别病原体相关的分子模式(PAMPs)后激发天然免疫反应，它也是连接天然免疫和获得性免疫的枢纽。TLRs的活化有两面性，一方面 TLRs正常活化可以启动天然免疫和获得性免疫，达到有效清除病原微生物的作用；另一方面 TLRs的异常或过度活化可能引起全身炎症相关病变。Rab7是 Rabs家族一个重要成员，主要定位在晚期内体/溶酶体相关的细胞器上，能调节早期内体到晚期内体的转运或早晚期内体的融合，以及可能调节囊泡运输的各个环节，最近的研究也表明 Rab7也可能调节细胞跨膜信号转导。本文旨在研究 Rab7沉默后在LPS和PolyI:C的刺激下对RAW264.7分泌细胞因子的影响，从而探讨Rab7对 TLR4/TLR3信号转导通路的调控作用。我们首先设计并合成了 Rab7-siRNA干扰序列，用脂质体瞬时转染到 RAW264.7细胞中，然后通过 Real-time PCR和Western blot的方法检测干扰效果，另外还通过 MTT法分析 Rab7基因沉默对 RAW264.7细胞生长状况的影响。之后，以 LPS和PolyI:C刺激 RAW264.7细胞不同时间，我们通过 RT-PCR和Real-time PCR方法检测了细胞因子的表达变化。研究结果发现，转染 Rab7-siRNA-3后，Rab7的mRNA和蛋白表达量显著降低(p<0.05)，并且 Rab7基因沉默能显著促进 RAW264.7细胞增殖(p<0.05)。我们还发现 Rab7基因沉默后，以 LPS刺激 RAW264.7细胞后分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-β、IP-10、NO/iNOS等细胞因子以及 TLR4的mRNA表达量明显增加(p<0.01或 p<0.05)，其中 TNF-α、IL-1β、IL-6、 IFN-β和IP-10在6h达到最大值；而 NO和iNOS在12h达到最大值；TLR4则是4h达最大值。以 PolyI:C刺激 Rab7基因沉默的RAW264.7细胞后分泌的细胞因子 IFN-β、IP-10和iNOS的表达量也有增加，但差异不显著。综上所述，我们成功的转染了 Rab7-siRNA序列，并认为 Rab7基因沉默能促进 RAW264.7的增殖，而且 Rab7可以负向调控 TLR4/TLR3信号转导通路。本实验应用了 Rab7-siRNA瞬时转染巨噬细胞 RAW264.7的方式研究 Rab7对 TLR4/TLR3信号通路的影响，为Rab蛋白对 TLRs信号通路调控的研究提出了新的思路，并有助于为 TLRs信号转导相关疾病寻求新的靶点。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

1 引言

1.1 Toll 样家族

1.2 Rab 蛋白家族

1.3 RNA 干扰技术

1.4 研究意义及目的

2 Rab7 瞬时沉默表达模式及基因沉默对 TLR4/TLR3 通路的影响

2.1 材料

2.2 实验方法

2.3 结果分析

3 讨论

4 结论

5 展望

致谢

参考文献

作 者 简 介