H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制

摘要

H9N2亚型禽流感病毒在全世界流行广泛，危害巨大。通常该亚型禽流感病毒为低致病性，感染禽类后不会引起大批死亡。但最近发现感染该亚型病毒的禽类死亡率很高，应用多聚酶链式反应（PCR）方法诊断，发现感染本病禽类脏器中同时存在H9N2亚型禽流感病毒和新发现的鸭坦布苏病毒。基于此问题，本研究分别对H9N2亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的生物学特性进行了深入研究，并对预防这两种病毒的疫苗进行了初步探讨研究。
　　为掌握我国H9N2亚型禽流感病毒流行株的生物学特性，本研究选取2003～2010年分离到的27株病毒进行了系统深入的研究。遗传演化分析发现我国H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化复杂，部分毒株PA和NS基因与H9N2亚型禽流感病毒参考序列的同源性均不高，表明这些基因可能来源于其它亚型的流感毒株，序列分析发现 H9N2亚型禽流感病毒近期分离株的基因片段主要起源于Ck/Shanghai/F/98(H9N2)株。交叉血凝抑制实验及病毒中和实验表明近年来我国H9N2亚型禽流感病毒的抗原性发生了明显的改变。对BALB/c小鼠致病性实验说明我国H9N2亚型禽流感病毒对小鼠的致病能力呈现下降趋势，尤其是2006年后的病毒分离株在小鼠体内的复制能力明显低于早期分离株。挑取处在不同进化分支的4株H9N2亚型禽流感病毒对4周龄SPF鸡进行了鼻腔接种致病性实验，发现这些毒株主要在感染鸡的气管和肺脏中增殖，但不出现明显症状。
　　根据上述抗原性分析结果，从 H9N2亚型禽流感病毒分离株中筛选出一株病毒Ck/Shanghai/441/09（H9N2）（简称Ck441）进行了初步的疫苗（免疫学）研究。Ck441病毒尿囊液灭活后制备灭活（毒株）疫苗，免疫4周龄SPF鸡，免疫3周后，用Ck441和一株2011年H9N2亚型禽流感病毒分离株进行攻毒实验，发现免疫组鸡均不发病、不排毒，而对照组鸡100％排毒，表明Ck441是一株理想的疫苗候选株。为提高病毒株的在细胞上的增殖能力，把Ck441的HA和NA插入到pBD载体SapI酶切位点之间，分别拯救获得了4株重组病毒，通过鸡胚和细胞增殖实验，发现441HANA/PR8-mutNS在鸡胚和细胞上增殖滴度都很高，将该株病毒经鸡胚和细胞扩增、灭活后制备灭活疫苗并免疫SPF鸡，都能够达到100%的保护率。
　　鸭坦布苏病毒是2010年4月以来引起鸭产蛋量下降、生长阻滞甚至死亡的新发鸭传染性疾病的病原，为获得此病毒对哺乳动物和鸡的致病信息，将鸭坦布苏病毒奉贤分离株（FX2010）人工感染BALB/c小鼠和SPF鸡。经肌肉和腹腔注射接种小鼠，各组织脏器均没检测到病毒；经鼻腔接种小鼠，FX2010病毒可在BALB/c小鼠的肺脏中复制增殖；脑内接种，BALB/c小鼠出现明显的临床症状，被毛逆立，体重下降，在小鼠的脑和肺脏中均可分离到病毒，随着接种病毒量的增加，小鼠体重下降更加明显；经8d后，脑内病毒含量仍然很高，而肺脏中的病毒含量明显降低。FX2010经肌肉和鼻腔接种2周龄SPF鸡，经鼻腔接种鸡体重增长明显减缓，肌肉接种体重变化与对照组无明显差异。病毒分离发现，经鼻腔和肌肉接毒的鸡在多个脏器均可分离到病毒；FX2010病毒经鼻腔接SPF产蛋鸡，实验组鸡排出绿色粪便，产蛋量呈现一过性下降，部分脏器能够检测到病毒。在感染鸡的整个实验过程中，未见鸡严重发病或死亡，表明该病毒对鸡呈现低致病性。
　　为初步研制防控鸭坦布苏病毒病的DNA疫苗，将鸭坦布苏病毒E基因和密码子优化后E基因分别插入到真核表达载体pCAGGS，通过IFA和Western blot实验，证明两种重组质粒在真核细胞内都能表达具有免疫原性的E蛋白，而优化后的重组质粒较野生型的表达量更高。重组疫苗（毒株）质粒免疫小鼠后，用间接 ELISA检测两种DNA疫苗免疫小鼠的血清抗体，发现密码子优化后E基因的质粒激发的抗体效价高于未优化质粒，该试验为DNA疫苗防治鸭坦布苏病毒病提供了初步研究数据。
　　总之，本研究阐明了H9N2亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的部分生物学特性，初步研制了H9N2亚型禽流感的灭活疫苗和鸭坦布苏病毒病的DNA疫苗质粒。这些研究为H9N2亚型禽流感病毒病和鸭坦布苏病毒病的防治提供坚实的理论依据。

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附表清单

引言

1 A型流感病毒

2 H9N2亚型禽流感病毒

3 流感病毒的疫苗研制

4 反向遗传操作技术

5 鸭坦布苏病毒

6 DNA疫苗研究进展

7 本实验研究的目的和意义

第一部分 H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及抗原性分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

第二部分 H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

第三部分 H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

第四部分 H9N2亚型重组流感病毒的拯救及其生物学特性的研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

第五部分 鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠及SPF鸡的致病性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

第六部分 鸭坦布苏病毒DNA疫苗的初步研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论与小结

第七部分 全文结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介