蒙药复方特润舒都乐石油醚提取物及其主要单体抗炎信号通路的研究

摘要

炎症（inflammation）作为一种临床常见的症状，普遍发生于机体各个部位。蒙医药是内蒙古特色医药。前期研究已经确立了蒙药复方特润舒都乐“Terun sodolol”，具有很好的抗炎和提高免疫作用，在动物模型以及临床奶牛乳房炎的治疗中取得了显著疗效，但尚存在用药剂量过大、作用机理不清楚等问题，故进一步研究其抗炎作用显著的石油醚提取物及主要单体的抗炎信号转导途径，旨在细胞分子水平上为其二次开发奠定理论基础。
　　为此，应用天然药物化学、有机化学等知识，利用液相色谱等技术分离鉴定有效活性成分，结合文献指导，确立了石油醚提取物有效单体成分，利用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7巨噬细胞体外建立炎症模型，观察石油醚提取物、单体及单体复合物抗炎作用及LPS-TLR4-cytokines/NF-κB信号转导途径。
　　蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物体外抗炎作用的研究试验如下：设置不同的LPS浓度（浓度设置为0.5、1、2、5、10、25μg/mL），干预RAW264.7巨噬细胞24h后，收集细胞上清进行ELISA检测，检测标准品绘制标准曲线，计算得出上清液肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）含量，根据结果确定最显著的LPS作用浓度为25μg/mL。蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物1、5、10、25、50mg/mL作用于RAW264.7巨噬细胞，检测细胞增殖能力（CCK-8法），结果显示50mg/mL浓度组与空白对照组比较有显著差异（P<0.05），对细胞生长有抑制作用，其余各组均无显著差异(P>0.05)，说明对细胞生长无影响。故后期试验选择5mg/mL、10mg/mL、25mg/mL浓度梯度进行，实验分为空白对照组，炎症模型组，炎症模型+阳性对照组，炎症模型+药物处理组。ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-1β含量，Real-time方法检测TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达，结果显示：LPS模型组比空白对照组TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白分泌及mRNA表达均显著升高（P<0.05），炎症模型+药物处理组 TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白分泌及mRNA表达与LPS模型组比较显著性降低（P<0.05），呈现剂量依赖性。说明蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物有抗炎和细胞保护效应，与抑制炎性细胞因子的产生有关。
　　蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物主要单体及其单体复合物对巨噬细胞RAW264.7细胞作用的有效浓度及时间：蒙药复方“Terun sodolol”主要单体及单体复合物作为试验药物，作用于RAW264.7巨噬细胞，检测细胞增殖能力。细胞增殖能力检测实验（CCK-8）结果显示：蒙药复方主要单体成分胡黄连苷Ⅱ、姜黄素、大黄素、大黄酸，高、中、低剂量组在不同时间点（0、6、12、24、48h）作用于RAW264.7细胞，并没有明显影响细胞生存活力。显示在各单体高浓度组作用时间48h显著地降低了细胞生存率，并发现单体复合物的保护效应较单体略微大一些。因此，根据不同浓度下保护效应明显的原则和药物组合的原则选择了高浓度单体组和中等浓度单体复合物组，作用时间点为24h。
　　蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物主要单体及单体复合物对LPS诱导RAW264.7细胞细胞增殖能力的影响：实验分为正常细胞对照组、炎症模型组、炎症模型+各单体给药组、炎症模型+单体复合物组、炎症模型+吡咯烷二硫代氨基甲酸盐组（PDTC；20μM）、炎症模型+PDTC+单体复合物组、炎症模型+地塞米松组（Dex；10μg/mL）。结果显示：与正常细胞对照组比较，LPS的刺激显著降低了巨噬细胞活力，而单体及单体复合物试验药物及PDTC、地塞米松阳性对照药减轻该细胞的死亡，不同程度地恢复了细胞的存活率。
　　蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物主要单体及单体复合物对LPS诱导RAW264.7细胞产生细胞因子的影响：实验分为正常细胞对照组、炎症模型组、炎症模型+各单体给药组、炎症模型+单体复合物组、炎症模型+ PDTC、炎症模型+PDTC+单体复合物组、炎症模型+地塞米松组。ELISA结果显示LPS模型组较正常细胞对照组TNF-α、IL-6、IL-1β分泌显著升高；各单体及单体复合物试验药物、阳性对照药与模型组比较均显著降低了TNF-α、IL-6、IL-1β分泌。
　　蒙药复方石油醚提取物主要单体及单体复合物对 LPS诱导 RAW264.7细胞TLR-4/NF-κB信号通路的研究：实验分为正常细胞对照组、炎症模型组、炎症模型+各单体给药组、炎症模型+单体复合物组、炎症模型+ PDTC、炎症模型+PDTC+单体复合物组、炎症模型+地塞米松组。蛋白质水平，用Western blot分析各单体及单体复合物试验药物对TLR4/NF-κB信号通路的影响，检测了磷酸化IκBα（P-IκBα）、P65、P- P65（磷酸化P65）、TLR-4蛋白，结果显示LPS模型组与正常对照组比较TLR-4、P-IκB、NF-κBP-P65蛋白表达显著，说明LPS刺激激活了TLR-4/NF-κB信号通路，而蒙药复方“Terun sodolol”石油醚提取物单体及单体复合物试验药拮抗内毒素LPS的作用显著降低了TLR-4、P-IκB、NF-κBP-P65蛋白的表达；real-time检测TLR-4、NF-κBP65，结果显示在转录水平LPS模型组与正常对照组比较 TLR-4、NF-κB-P65mRNA表达显著，而蒙药复方石油醚提取物单体及单体复合物试验药拮抗内毒素 LPS的作用显著降低 TLR-4、NF-κBP65蛋白的mRNA表达。采用凝胶迁移实验（EMSA）检测DNA结合能力，检测NF-κBP65（核蛋白）活性，结果LPS模型组与正常对照组比较差异显著，NF-κBP65（核蛋白）活性及含量增加，而蒙药复方石油醚提取物单体及单体复合物试验药削弱内毒素LPS的作用，显著降低了NF-κBP65（核蛋白）活性及含量。
　　以上结果说明蒙药复方石油醚提取物、单体及其单体复合物试验药拮抗内毒素LPS的作用，是通过LPS-TLR4?cytokines/NF-κB信号通路实现的。

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插图和附表清单

缩 略 词 表

1 引言

1.1 研究目的和意义

1.2 蒙医药研究进展

1.3 奶牛乳房炎研究进展

1.4 炎症研究进展

1.5 经TLR-4受体复合物的内毒素信号转导通路

2 脂多糖（LPS）致RAW264.7巨噬细胞损伤造成体外炎性模型的建立

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

3 蒙药复方特润舒都乐石油醚提取物体外抗炎作用的研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

4 蒙药复方石油醚提取物主要单体及其单体复合物对巨噬细胞RAW264.7细胞作用的有效浓度及时间

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

5 蒙药复方石油醚部位各主要成分对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7细胞的保护作用

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

6 蒙药复方石油醚提取物主要单体及单体复合物对 LPS 诱导 RAW264，7 细胞TLR-4/NF-κB信号通路的研究

6.1 实验材料与方法

6.2 结果

6.3 讨论

7 总体讨论

8 结论

9 创新点

致谢

参考文献

作 者 简 介