蒙药特润舒都乐水母液浸膏及其主要单体通过TLR4的抗炎信号转导机制研究

摘要

蒙药特润舒都乐(TRSDL)是课题组为治疗奶牛乳房炎而配置的，经多年研究应用于治疗奶牛乳房炎的抗炎免疫复方。发现蒙药特润舒都的水母液浸膏也具有良好的抗炎和提高机体免疫力的作用。研究复方蒙药特润舒都乐水母液浸膏及其主要活性成分的抗炎免疫机制，为蒙药特润舒都乐治疗奶牛乳腺炎提供理论依据，实验方法和结果如下:
　　①采用细菌脂多糖LPS诱导小鼠RAW264.7细胞构建炎症细胞模型。
　　②采用CCK8法检测TRSDL的水母液浸膏及其主要活性成分对RAW264.7细胞的增殖作用的影响，结果:低浓度TRSDL水母液浸膏（1.00、5.00、10.00、25.00 mg/mL）对小鼠RAW264.7细胞没有生长抑制作用，与不加药物的空白对照组相比没有显著性差异(p＞0.05)，而高浓度TRSDL水母液浸膏（50.00mg/mL）显著抑制小鼠RAW264.7细胞的生长(p＜0.05); TRSDL水母液浸膏的主要活性成分单体栀子苷20mmol/L、没食子酸32μg/L和盐酸小檗碱40μ mol/L分别单独作用48h能够明显抑制RAW264.7细胞的生长(p＜0.05)。由3种单体组成的复合物在该浓度时作用48h也能够显著抑制RAW264.7细胞的生长(p＜0.05)。
　　③采用荧光定量RT-PCR法检测TRSDL的水母液浸膏对LPS诱导RAW264.7细胞的IL-1、IL-6、TNF-α、TLR4及NF-κB mRNA的影响，ELISA的方法检测IL-1、IL-6、TNF-α蛋白质的表达，Western Blotting法检测TLR4、NF-κB蛋白质的表达，结果:TRSDL的水母液浸膏浓度依赖性地抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞产生炎症因子IL-1、IL-6及TNF-α mRNA的含量及其蛋白质的表达(p＜0.05)，10mg/mL和25mg/mLTRSDL水母液浸膏抑制作用与地塞米松的效果相当(p＜0.05)。TRSDL的水母液浸膏浓度依赖性地抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白质的表达。
　　④WST-8方法检测TRSDL水母液浸膏的活性成分及其复合物对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖率的影响，结果:单体栀子苷、没食子酸、盐酸小檗碱及3种单体复合物、NF-κB抑制剂PDTC和地塞米松分别能够显著缓解LPS对小鼠RAW264.7细胞增殖的抑制作用(p＜0.05)。
　　⑤采用ELISA的方法检测TRSDL水母液浸膏的主要活性成分对LPS诱导的RAW264.7细胞的炎性因子IL-1、IL-6和TNF-α释放的影响，结果:栀子苷、没食子酸、盐酸小檗碱及3种单体复合物能够显著抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞的IL-1、IL-6及TNF-α表达，与蒙药特润舒都乐水母液浸膏结果均一致。
　　⑥进一步运用Western Blotting法和EMSA法检测TRSDL水母液浸膏的主要活性成分的单体及复合物对LPS诱导的RAW264.7细胞p-IκBα、p-p65、p65及TLR4的蛋白表达和P65与启动子结合活性的影响。结果:TRSDL单体栀子苷、没食子酸、盐酸小檗碱及3种单体组成的复合物、NF-κB抑制剂PDTC和地塞米松不影响总p65蛋白质水平，但分别能够显著抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞的磷酸化IκBα和p65蛋白质表达(p-IκBα和p-p65)(p＜0.05)。各用药组显著抑制LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞TLR4 mRNA含量和蛋白质表达，与蒙药特润舒都乐水母液浸膏结果一致。单体栀子苷、没食子酸、盐酸小檗碱、3种单体复合物、NF-κB抑制剂PDTC和地塞米松分别能够显著减少LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞p65与启动子结合的活性(p＜0.05)。
　　综上所述，实验成功构建了细菌脂多糖LPS诱导小鼠RAW264.7细胞炎症细胞模型;确定了蒙药特润舒都乐水母液浸膏及其主要活性成分的用药量:对小鼠RAW264.7细胞的作用浓度可选为水母液浸膏低于（50.00mg/mL），而TRSDL水母液浸膏的主要活性成分单体栀子苷、没食子酸和盐酸小檗碱分别选用文献中常用的20mmol/L、32μg/L、40μmol/L;蒙药特润舒都乐水母液浸膏能够显著抑制LPS诱导RAW264.7细胞的TNF-α、IL-1和IL-6 mRNA含量及其蛋白质的表达，同时在转录水平和蛋白质水平显著抑制其TLR4和NF-κB含量，提示蒙药特润舒都乐水母液浸膏可通过TLR4-NF-κB通路发挥抗炎免疫作用。蒙药特润舒都乐的3种单体及其复合物能在转录水平和蛋白水平显著下调LPS诱导RAW264.7细胞的IL-1、IL-6和TNF-α的表达。同时，可初步推测3种单体及其复合物抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应可以通过抑制TLR4，进而减少IκBα和p65亚基的磷酸化，抑制p65的活性，减少p65与调控IL-1、IL-6及TNF-α等炎症因子表达的启动子的结合而实现。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 炎症

1．1．1 炎症反应

1．1．2 中性粒细胞炎症反应

1．1．3 巨噬细胞炎症反应

1．2 模式识别受体(PRR)

1．2．1 模式相关分子病原(PAMP)和死亡相关分子病原(DAMP)

1．2．2 Toll样受体(TLR)

1．3 NF-κB信号通路

1．3．1 NF-κB与抑制κB蛋白(IκB)家族

1．3．2 NF-κB与DNA和IκB的结合

1．3．3 NF-κB活化的影响

1．4 LPS与奶牛乳腺炎

1．4．1 TNF-a

1．4．2 IL-1

1．4．3 IL-6

1．5 蒙药

1．5．1 蒙药的种类特点

1．5．2 蒙药的用药理论

1．5．3 蒙药的成药剂型

1．5．4 蒙药与中药的关系

1．4．5 蒙药与疾病的研究进展

1．6 蒙药特润舒都乐

1．7 研究问题的提出

2 蒙药特润舒都乐水母液浸膏对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW284．7细胞分泌炎性因子的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 实验数据统计方法

2．3 试验结果

2．3．1 不同浓度蒙药复方特润舒都乐水母液浸膏对小鼠RAW264．7细胞生长的影响

2．3．2 不同浓度蒙药复方特润舒都乐水母液浸膏对RAW264．7细胞IL-1、IL-6、TNF-α mRNA分泌的影响

2．3．3 不同浓度蒙药复方特润舒都乐水母液浸膏对小鼠RAW264．7细胞IL-1、IL-6、TNF-α蛋白含量的影响

2．4 讨论

2．5 小结

3 蒙药特润舒都乐水母液浸膏对LPS诱导RAW264．7细胞TLR4和NF-κB信号转导通路的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 数据处理及统计分析

3．3 结果

3．3．1 蒙药特润舒都乐水母液浸膏对RAW264．7细胞TLR4、NF-κBmRNA的影响

3．3．2 蒙药特润舒都乐水母液浸膏对RAW264．7细胞TLR4、NF-κB蛋白质表达的影响

3．4 讨论

3．5 小结

4 蒙药特润舒都乐水母液浸膏主要活性成分及其复合物对LPS诱导小鼠RAW264．7细胞细胞因子表达及TLR4-NF-κB信号通路的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 蒙药特润舒都乐水母液浸膏主要活性成分及其复合物对巨噬细胞RAW264．7作用的有效浓度及最佳时间的确定

4．2．2 不同单体及其复合物作用对LPS诱导RAW264．7细胞增值率的影响

4．2．3 蒙药特润舒都乐水母液浸膏主要活性成分及其复合物作用对LPS诱导RAW264．7细胞IL-1、IL-6和TNF-α的影响

4．2．4 蒙药特润舒都乐水母液浸膏主要活性成分及其复合物对LPS诱导小鼠RAW264．7细胞TLR4 mRNA和p65 mRNA的影响

4．2．5 蒙药特润舒都乐水母液浸青主要活性成分及其复合物对TLR4-NF-κB信号通路蛋白的影响

4．2．6 蒙药特润舒都乐主要单体及其复合物对LPS诱导的RAW264．7细胞p65活性的影响

4．3 讨论

4．4 小结

5 结论

6 创新点

7 展望

致谢

参考文献

作者简介