马传染性贫血病Rev蛋白单克隆抗体的制备及表位鉴定

摘要

马传染性贫血病毒(EIAV)是反转录病毒科慢病毒属成员之一，可引起严重的马属动物传染病-马传染性贫血病(EIA)。慢病毒可不断变异逃脱宿主免疫监视，该特性是慢病毒疫苗很难研制成功的重要因素，而EIAV作为首个研制出疫苗并成功应用的的病毒，被认为是研究慢病毒感染免疫机制的重要模型。Rev蛋白作为EIAV的辅助蛋白之一，主要承担在病毒复制晚期向核外转运未完成剪切的mRNA的作用，以促进病毒的组装。所以，Rev在EIAV细胞内复制中起着重要作用。最新研究显示，在疾病感染的不同临床阶段Rev会产生变异形成不同的亚型，因此，对其结构和功能研究将对研制针对慢病毒的疫苗和药物提供重要的基础研究数据。
　　单抗是用于对蛋白功能进行研究的重要工具。为此，本研究通过PCR获得Rev目的基因，通过双酶切将其克隆到pET30a原核表达载体上，通过原核表达和蛋白纯化，获得纯度高并具有免疫原性的Rev蛋白。用Rev蛋白免疫8周龄的BALB/c小鼠，通过细胞融合技术获得了一株分泌针对Rev抗体的杂交瘤细胞株，命名为2D9。经Western blot、间接ELISA和间接免疫荧光鉴定，确证获得单抗具有较高的敏感性和特异性。通过肽扫描技术对2D9单抗进行了B细胞表位鉴定，针对表位为71QHTPSRRDRWIRGQ84，位于Rev蛋白的RNA结合区域(RBD)。该单抗不但为研究Rev蛋白结构和功能提供了基础工具，而且为研究Rev与mRNA结合的作用机制提供了重要基础。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 马传染性贫血概述

1．2 马传染性贫血病毒概述

1．2．1 EIAV的形态结构和理化性质

1．2．2 EIAV的生物学特性

1．2．3 EIAV的基因组和蛋白

1．3 EIAV感染周期

1．4 Rev蛋白

1．4．1 Rev蛋白的功能域和结构

1．4．2 Rev蛋白的作用

1．4．3 Rev的多样性

1．5 单克隆抗体技术

1．6 表位鉴定技术

1．7 研究目的和意义

2．材料与方法

2．1 材料

2．1．1 病毒株、质粒和菌株

2．1．2 主要试剂及实验动物

2．1．3 溶液和常用培养基

2．1．4 仪器

2．2 方法

2．2．1 Rev基因原核表达重组质粒的构建

2．2．2 重组质粒的鉴定

2．2．3 重组质粒的原核表达

2．2．4 蛋白纯化

2．2．5 Rev蛋白单克隆抗体的制备

2．2．6 表位鉴定

3 结果

3．1 Rev基因

3．2 重组质粒pET-Rev的鉴定

3．3 蛋白SDS-PAGE分析

3．4 单克隆抗体的制备和鉴定

3．4．1 阳性杂交瘤细胞株筛选方法(ELISA)的建立

3．4．2 融合后杂交瘤细胞的筛选

3．4．3 单抗亚型鉴定结果

3．4．4 单抗Western blot鉴定结果

3．4．5 单抗间接免疫荧光(IFA)鉴定结果

3．4．6 腹水效价的测定

3．4．7 腹水的纯化

3．5 抗原表位鉴定

3．5．1 抗原表位的初步鉴定

3．5．2 抗原表位的精确鉴定

4．讨论

4．1 重组质粒的构建和表达

4．2 单抗与抗原的反应活性

4．3 阳性杂交瘤细胞的筛选及腹水的制备

4．4 表位鉴定

4．5 2D9 MAb的应用前景

5 结论

致谢

参考文献

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