益生菌L.plantarumP-8对肉鸡肠道菌群、肠道免疫和生长性能影响的研究

摘要

乳酸杆菌是肠道具有生理意义的菌群，以乳酸杆菌作为益生菌剂是近年崛起的新型替代抗生素促生长剂绿色饲料添加剂。本论文以益生菌L.plantarum P-8为试验菌株，从鸡肠道菌群、肠道免疫和生产性能三个方面评价L.plantarum P-8替代抗生素的可行性。并深入剖析肠道菌群与肠道免疫和肠道菌群与生产性能间相互作用的内在规律，以期揭示益生乳酸菌调控肠道菌群发挥益生作用的机制。
　　本试验以玉米、豆粕型日粮为基础日粮，采用单因子随机分组的试验设计方案，将270只刚孵出的健康Cobb500肉鸡称重后分为3组。1组为对照组(ControlG)，饲喂不添加抗生素的基础日粮;2组为抗生素组(Antibiotic G)，饲喂添加金霉素和盐霉素的抗生素日粮;3组为Lp-8组(LP-8 G)，饲喂不添加抗生素的基础日粮，但饮水投喂L.plantarum P-8(2.0×106cfu/mL)。试验期42天。
　　首先，采用454焦磷酸测序技术比较肉鸡摄入L.plantarum P-8和抗生素后42日龄肉鸡肠道菌群群落结构发生的改变。结果发现，饲喂益生菌和抗生素鸡肠道细菌菌群群落结构均差异显著(p＜0.05)。其次，采用荧光定量PCR技术，基于属和种的分类学层面，结合优势菌属、乳酸杆菌种和双歧杆菌种定量数据，精细解析肉鸡摄入L.plantarum P-8和抗生素后，7、28、42日龄肉鸡肠道菌群在分类学地位属及种的层面发生的细微变化。结果发现，摄入L.plantarum P-8后，可显著提高7、28、42日龄肉鸡肠道中总细菌、乳杆菌属和双歧杆菌属数量(P＜0.01)，并可显著提高28、42日龄肉鸡肠道梭杆菌属数量(P＜0.05)，同时可显著降低7、28、42日龄肉鸡肠道中埃烯氏菌属数量(P＜0.01);而采食抗生素日粮，可显著降低28、42日龄肉鸡肠道中奇异菌属数量（P＜0.01）。
　　于试验第42天，摘取脾脏、胸腺和法氏囊，计算免疫器官指数;采用ELISA法检测14、42日龄肉鸡血清IgG和肠粘膜SIgA含量;采用荧光免疫组化法检测14、42日龄肉鸡小肠粘膜、派伊尔结和盲肠扁桃体CD3+、IgA+细胞数量了解其表达情况;利用流式细胞仪检测14、42日龄肉鸡脾脏、小肠上皮内、固有层和盲肠扁桃体CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞质量分数;采用荧光定量2-△CT法分析14、42日龄肉鸡肠道细胞因子IFN-γ、Bu-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12表达水平。结果发现，抗生素组和LP-8组42日龄肉鸡胸腺指数法、氏囊指数和脾脏指数均显著提高(P＜0.05）;雏鸡摄入L.plantarum P-8后，可显著提高14、42日龄肉鸡血液IgG及肠液中SIgA含量(P＜0.05）;饮水投喂L.plantarum P-8可显著提高肉鸡小肠粘膜、盲肠扁桃体CD3和IgA阳性细胞数以及派伊尔结IgA阳性细胞数（P＜0.01）。抗生素的摄入显著降低了42日龄肉鸡小肠粘膜IgA、派伊尔结CD3和IgA以及盲肠扁桃体CD3阳性细胞数(P＜0.01);摄入L.plantarum P-8可显著提高14日龄肉鸡小肠粘膜、固有层和盲肠扁桃体CD4+、CD8+及CD3+T细胞质量分数（P＜0.01），42日龄肉鸡小肠粘膜、固有层CD4+T细胞质量分数和CD4+/CD3+比值以及固有层和盲肠扁桃体CD3+T细胞质量分数（P＜0.01）。而采食抗生素日粮，显著降低了42日龄肉鸡小肠固有层CD4+、CD3+T和盲肠扁桃体CD3+T细胞质量分数;摄入L.plantarum P-8使42日龄肉鸡肠道Bu-1和IL-12显著高于对照组(P＜0.05）。采食抗生素日粮，肉鸡肠道IL-2、IL-4、IL-10显著低于对照组P＜0.05)。
　　生长性能结果表明，LP-8组22～42日龄肉鸡日增重显著高于对照组（P＜0.05）;抗生素组肉鸡在1～21、22～42日龄及全期日增重均显著高于对照组(P＜0.05)。
　　通过以上的实验结果，我们得出的总体结论是:具有益生特性的L.plantarumP-8能够存活于宿主肠道内，改善肠道菌群群落结构，减少有害菌的粘附、侵染、定植，促进有益菌生长，增强肠道防御功能;对肉鸡的体液免疫、细胞免疫和肠道相关淋巴组织免疫可产生有利于机体免疫功能状态的调节作用;能够显著提高肉鸡后期生长阶段生长性能。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 引言

1．1 抗生素使用的危害

1．1．1 抗生素残留

1．1．2 抗生素使用不当所造成的抗性基因污染

1．1．3 抗生素对肠道菌群的不良影响

1．2 益生乳酸菌的益生效果

1．2．1 益生乳酸菌的营养作用

1．2．2 益生乳酸菌的生理功能作用

1．3 肠道菌群及其对宿主的作用

1．3．1 鸡肠道菌群组成及其发育的研究

1．3．2 肠道微生物对宿主免疫的作用

1．3．3 肠道菌群对宿主代谢的作用

1．3．4 肠道菌群对生长性能的作用

1．4 L．plantarum P-8的来源及特性

1．5 本研究的目的意义及主要内容

1．5．1 立题背景和意义

1．5．2 本课题研究的主要内容

1．5．3 技术路线

2 材料和方法

2．1 实验仪器和设备

2．2 实验动物及其基础条件

2．2．1 饲料配方

2．2．2 实验动物的饲养

2．3 试验方法

2．3．1 标准菌菌体DNA和肠道菌群总DNA的提取

2．3．2 454焦磷酸测序技术

2．3．3 荧光定量PCR(RT-qPCR)

2．3．4 ELISA测定指标

2．3．5 肉鸡免疫器官指数的测定

2．3．6 鸡肠道免疫指标检测

2．4 数据的统计分析及图表绘制

3 结果

3．1 试验一 L．plantarum P-8和抗生素对肉鸡肠道菌群群落结构影响的差异

3．1．1 三组肉鸡肠道菌群群落结构分析

3．1．2 肉鸡肠道优势菌群定量分析

3．1．3 L．plantarum P-8在肉鸡肠道内存活分析

3．2 试验二 L．plantarum P-8对肉鸡免疫影响分析

3．2．1 L．plantarum P-8对肉鸡免疫器官指数的影响

3．2．2 各组血清IgG变化

3．2．3 各组肠粘膜SIgA

3．2．4 各组小肠、派伊尔结、盲肠扁桃体CD3+、IgA细胞数

3．2．5 L．plantarum P-8及抗生素对肉鸡脾脏、肠道上皮、固有层和盲肠扁桃体T淋巴细胞亚群影响的差异

3．2．6 小肠细胞因子IFN-γ、Bu-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12的测定

3．2．7 益生菌L．plantarum P-8对肉仔鸡生长性能的影响

4 讨论

4．1 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肠道菌群影响的差异

4．1．1 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肠道菌群群落结构影响的差异

4．1．2 肉鸡肠道菌群的演替

4．1．3 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肠道菌群演替影响的差异

4．1．4 乳酸杆菌种在肉鸡肠道菌群中的演替及三组间差异的比较

4．1．5 双歧村菌种在肉鸡肠道中的演替及三组间差异的比较

4．2 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肉鸡免疫功能影响的差异

4．2．1 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肉鸡免疫器官指数影响的差异

4．2．2 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肉鸡血清IgG和肠粘膜SIgA分泌量影响的差异

4．2．3 各组肉鸡小肠、派伊尔结、盲肠扁桃体CD3+、IgA+细胞数的差异比较

4．2．4 各组肉鸡脾脏、肠上皮、固有层和盲肠扁桃体T淋巴细胞亚群的差异比较

4．2．5 各组肉鸡小肠细胞因子的差异比较

4．3 益生菌L．plantarum P-8和抗生素对肉仔鸡生长性能影响的差异

4．4 总体讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

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