脂多糖诱导绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达及其机制研究

摘要

绵羊输卵管炎是一种季节性多发的生殖道炎症，由外源微生物感染引起，免疫系统紊乱的综合性疾病。其中大肠杆菌所引起的输卵管炎较为常见。大肠杆菌引起机体免疫反应的主要成分是其细胞壁的组成成分脂多糖（LPS）。
　　β-防御素是一种重要的抗菌肽分子，广泛表达于哺乳动物和鸟类的黏膜上皮组织，具有重要的抗感染功能，是固有免疫的重要组成部分。β-防御素对机体有着重要的生理作用，它可以直接杀死病原菌，具有广谱抗菌性、抗细胞毒性、抗病毒及调节免疫的作用，是输卵管中自然产生的对抗微生物感染的重要屏障。β-防御素作为输卵管对抗微生物感染的重要屏障，可作为预防和治疗输卵管炎的新型抗感染药物。近年来，也有越来越多的研究表明β-防御素的表达水平可以被LPS上调。然而，在绵羊输卵管中β-防御素是否会被LPS上调及其转录调控机制尚缺乏系统的研究。本实验即针对这些问题，以LPS模拟细菌侵染细胞为模型，研究在此过程中β-防御素的调控机制，为进一步探索输卵管炎发病机理、合理开发及运用输卵管炎相关药物提供理论基础。
　　1.改进实验室已建立的绵羊输卵管上皮细胞培养体系。采用0.05％胰酶消化法获得绵羊输卵管上皮细胞，对其进行原代培养，传代时采用差时消化法，以增加绵羊输卵管上皮细胞的纯度。通过形态学和免疫荧光的方法鉴定培养的细胞为上皮细胞，纯度达到95%以上。绘制的第三代绵羊输卵管上皮细胞生长曲线证明所培养的细胞符合细胞生长规律。
　　2.通过qRT-PCR方法检测绵羊输卵管上皮细胞中绵羊β-防御素-1（SBD-1）和绵羊β-防御素-2（SBD-2）基因的表达情况。结果表明，在绵羊输卵管上皮细胞中SBD-1 mRNA表达较高，SBD-2 mRNA检测不到。制备SBD-1多克隆抗体，通过免疫组化检测绵羊输卵管SBD-1蛋白的表达定位情况，结果表明，SBD-1主要表达于输卵管的黏膜层上皮细胞中，固有层细胞中有较少量表达。在培养的绵羊输卵管上皮细胞中添加10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL和1 mg/mL不同浓度的LPS进行刺激，并在0 h、1 h、3 h、6 h、12 h和24h不同时间点收取样品，运用qRT-PCR方法检测SBD-1 mRNA的表达情况。结果表明，LPS可显著上调SBD-1表达水平，且呈现浓度和时间依赖性。其中添加100 ng/mL LPS组与刺激12 h组SBD-1的表达量最高，与阴性对照组有极显著性差异。
　　3.通过Western Blot方法检测添加LPS后MAPK家族中P38、ERK1/2、JNK的表达变化，结果表明，P-P38、P-ERK1/2和P-JNK蛋白分别在20 min、10 min、10 min表达显著增加，说明LPS可以在很短时间内激活P38、ERK、JNK通路。通过免疫组化检测绵羊输卵管P38、JNK和ERK1/2的表达定位，结果表明，P38、JNK和ERK1/2在绵羊输卵管上皮细胞中均广泛分布，在固有层细胞中表达较少。在培养的上皮细胞中添加LPS和P38、JNK及ERK1/2抑制剂共孵育，运用qRT-PCR方法检测SBD-1的表达，结果表明，P38抑制剂可以明显阻断LPS对SBD-1 mRNA表达的上调作用，ERK1/2抑制剂可以在一定程度上阻断LPS对SBD-1表达的上调作用，而JNK抑制剂则完全无效。
　　4.采用PCR方法检测LPS细胞膜受体Toll样受体4（TLR4）的表达情况，结果表明，在绵羊输卵管上皮细胞中有TLR4 mRNA的表达。在培养的上皮细胞中添加TLR4特异性抗体，抑制TLR4受体的作用，并通过WesternBlot检测P38的表达变化。结果表明，阻断TLR4可以显著降低LPS对P38 MAPK通路的激活作用。添加LPS以及TLR4的特异性抗体共孵育，运用qRT-PCR方法检测SBD-1的表达，结果表明，阻断TLR4可以显著降低LPS对SBD-1表达的上调作用。
　　本实验研究表明LPS通过与TLR4受体结合，主要经P38 MAPK信号通路诱导绵羊输卵管上皮细胞表达SBD-1。

目录

声明

缩 略 词 表

1 引言

1.1 抗菌肽简介

1.3 研究目的及意义

1.4 技术路线

2 实验一 绵羊输卵管上皮细胞培养及特征鉴定

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

2.4 小结

3 实验二 LPS对绵羊输卵管上皮细胞SBD-1表达的影响

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

3.4 小结

4 实验三 LPS调控绵羊输卵管上皮细胞SBD-1基因的信号转导机制

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

4.4 小结

5 实验四 LPS受体检测

5.1 材料与方法

5.2 实验结果

5.3 讨论

5.4 小结

6 结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介