转录组测序揭示山羊和绵羊疼痛应答遗传机制研究

摘要

慢性疼痛是常见的复杂的神经病理与主观感受症状，在不同物种之间对疼痛的感受存在着明显的差别。脊髓背根神经节（dorsal root ganglion,DRG）是痛觉产生、维持和传导的初级中枢。因此研究DRG的转录组有助于系统认识慢性疼痛发生的调控机制和疼痛致病基因的筛选。本研究选择CFA疼痛处理（实验组）和未处理（对照组）的绵羊和山羊各2组，每组3只，取其DRG组织，通过RNA-seq高通量测序与生物信息学分析，揭示不同物种间疼痛响应的基因调控模式，取得如下主要结果：
　　1.疼痛的调控发生在转录水平、转录后水平和可变剪接水平。
　　2.差异基因聚类结果显示，实验组山羊和绵羊的基因表达模式发生了显著变化。
　　3.DEG分析，实验组山羊获得差异表达基因1,748个，绵羊2,441个；种间差异基因2,935个，其中，仅在绵羊DRG表达的基因426个，仅在山羊表达353个。
　　4.GO分析显示，山羊参与炎症应答、免疫应答、损伤应答和防御应答以及门控离子通道、神经递质及其受体等相关基因表达变化显著，如：CCL27、PRKACA、GABRA4、GRIA2、GRIK3、CACNA1E、SCN3A、KCNK1等基因通过上调或下调参与疼痛应答，发挥了关键调控作用，该结果提示炎性疼痛发生时山羊的免疫系统发生了显著变化。这些差异基因参与了Chemokine signaling pathway、Retrograde endocannabinoid signaling、Calcium signaling pathway、Glutamatergic synapse、MAPK signaling pathway等途径，它们的激活在山羊疼痛应答中起了关键作用。
　　5.GO分析显示，绵羊抑制性神经递质及其受体基因如GABRG3、GABRB2、GABRB1、GLRA3、CLCN7表达活跃；疼痛应答过程中SCN9A、SCN4B、SCN11A、SCN8A、SCN7A、SCN10A、TRPV1等编码电压-门控钠离子通道及参与钠离子运输、神经营养因子信号途径相关基因表达下调，其中SCN9A、TRPV1表达下调与疼痛耐受相关。差异基因参与GABAergicsynapse、Neurotrophin signaling pathway、Retrograde endocannabinoid signaling、Morphine addiction、Nicotine addiction、Neurotransmitter-gated ion-channel ligand-binding等通路，表明这些通路可能参与了绵羊疼痛应答过程。
　　6．种间差异基因GO分析显示，电压门控离子通道、损伤应答、炎症应答、防御应答等相关基因在绵羊和山羊的转录调控本底水平上存在一定的差异。
　　7．可变剪接事件分析显示疼痛应答过程中可变剪接事件减少，同时在两个物种中检测出大量新的可变剪接事件和可变剪接位点。从山羊6个样本中检测到新的可变剪接事件15576个，新的SJs107786个；从绵羊6个样本中检到新的可变剪接事件17260个，新的SJs为83358个。
　　8．可变剪接差异分析发现山羊AS差异基因371，绵羊360个。差异基因功能聚类结果显示，在绵羊疼痛应答过程中，参与调控Ras GTP酶活性和Ras蛋白信号转导相关基因可变剪接事件发生显著变化，FGD1、RABGAP1、TBC1D14、AGAP1、TBC1D1、SCRIB基因可变剪接事件下调；此外参与钠离子结合和运输基因、编码钙离子通道及离子运输相关基因可变剪接事件明显上调，这些基因主要有HCN2、ATP1A2、HCN4、CLCN3、TRPC4、KCNC4、CACNA2D1、SGK1、等。山羊疼痛应答过程中参与谷氨酸信号途径的GRIK1和GRIK2基因可变剪接发生显著变化。
　　分析发现绵羊和山羊在慢性疼痛应答过程中，其DRG组织基因表达模式发生显著变化，各种离子通道、神经递质及其受体、炎性介质、细胞因子、信号转导分子等基因通过上调或下调参与疼痛应答过程。本研究首次揭示了绵羊和山羊两个不同物种其疼痛的应答机制在转录水平、转录后调节水平、可变剪接调控水平存在差异。山羊可能通过增加外周敏化来传递疼痛，而绵羊可能通过抑制性神经递质来减弱疼痛信号传导，并发现了大量潜在的镇痛药物作用的靶点。该结果为疼痛产生、响应和症状的遗传基础和调控机制的深入认识及疼痛治疗药物的开发提供了科学参考。

目录

声明

缩 略 语 表

1 前 言

1.1 慢性疼痛介绍

1.2 转录组及其研究方法

1.3 RNA-seq技术

1.4 山羊/绵羊转录组研究进展

1.5 本研究目的和意义

2 DRG组织转录组建库和高通量测序

2.1 引言

2.2 试验材料

2.3 试验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

3.1 引言

3.2 分析方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

4. 转录组差异表达分析

4.1 引言

4.2 分析方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 小结

5.1 引言

5.2 分析方法

5.3 结果与分析

5.4 讨论

5.5 小结

6 全文结论

7 研究创新点与展望

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介