蒙古马高负荷运动训练前后转录组与miRNA文库特征及关联分析

摘要

蒙古马是典型的草原马种，经历了漫长的自然选择和人工选择，在草原上以半野生状态生存，所以蒙古马能适应极端恶劣的气候环境及粗放的饲养条件。其基因组中蕴藏着大量的与耐力、抗病、抗寒相关的具有重要利用价值的基因。本实验对6匹蒙古马进行了4个月高负荷运动训练，分别在训练前后采集血液和肌肉样品，检测血液中生理生化指标的变化情况的同时，利用二代测序技术对肌肉样品分别建立转录组和miRNA文库，对训练前后表达量差异显著的基因进行GO功能富集和KEGG Pathway分析，找到训练前后发生显著变化的代谢通路及运动相关候选基因，并将转录组数据与差异miRNA靶基因进行关联性分析，绘制蒙古马高负荷训练前后miRNA与差异表达mRNA的靶向调控网络关系图。然后在体外培养的蒙古马骨骼肌细胞上进行载体构建与细胞转染实验，从而在细胞水平上验证了miRNA与mRNA的靶向调控关系。
　　经过实验分析本文得到的主要研究结果如下：
　　1.训练后血液中血糖、肌酸激酶、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、血小板计数、血小板压积显著上升；而尿素、血红蛋白、血红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、红细胞分布宽度显著下降；血小板平均体积、血细胞比容、红细胞平均容量、乳酸脱氢酶、天冬氨酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶训练前后虽然有变化，但不显著。
　　2.转录组数据库筛选到了1102个显著差异基因，其中299个在训练后发生上调，803个下调。这些差异基因同时被注释到3398条GO terms与193条pathway上。其中与运动学紧密相关的生物过程有：肌肉结构发育、心血管系统发育、循环系统发育、肌肉组织发育、肌肉器官发育、肌肉收缩、肌细胞分化、扩张型心肌病、肥厚性心肌病、心肌收缩、钙信号通路、肌动蛋白骨架调节等。
　　3.miRNA文库共筛选得到248个差异miRNA，其中54个上调，194个下调。将差异显著的miRNA进行靶基因预测后进行GO功能富集分析发现，涉及的生物学过程包括：发育过程、解剖结构发育、蛋白质结合、酶结合等。并对531个靶基因进行了KEGG pathway注释，在210条被注释的信号通路中，显著富集并与运动相关的pathway包括：调节肌动蛋白细胞骨架，钙信号通路、心肌收缩等经典信号通路等。
　　4.把miRNA与转录组文库获得的数据结果进行关联分析，筛选出29个miRNA对236个基因具有显著靶向调控作用。其中15个上调miRNA靶向下调68个mRNA；14个下调miRNA靶向上调168个mRNA。将miRNA的靶基因结合差异表达基因进行GO功能富集和KEGG Pathway分析，涉及与运动直接相关的通路有：肌动蛋白细胞骨架调节、钙离子信号通路、心肌收缩、肥厚性心肌病，扩张型心肌病等。
　　5.对miRNA-1及其靶基因IGF1进行载体构建和细胞转染实验，通过RT-PCR检测miRNA-1、Pre-mir-1及IGF1相对表达量，结果说明Pre-mir-1成功进入骨骼肌细胞，加工为成熟的miRNA-1，抑制沉默了靶基因IGF1的表达，验证了miRNA-1与IGF1靶向调控关系及mRNA-miRNA联合分析结果的正确性。

目录

缩 略 词 表

1. 引言

1.1 赛马简述

1.2 蒙古马及其特点

1.3 蒙古马的耐力

1.4 蒙古马的现状

1.5 马运动学研究进展概述

1.6 马运动学转录组概述

1.7 miRNA测序进展即及马属动物应用概述

2．本研究的目的意义及技术路线

2.1 本研究的意义和目的

2.2 本研究的技术路线

3. 实验准备

3.1.实验材料

3.2 实验用马的训练及样品采集

3.3 蒙古马骨骼肌细胞体外培养

4. 实验方法

4.1 血液生理生化指标的检测

4.2 转录组高通量测序分析

4.3 miRNA测序分析

4.4 miRNA-mRNA整合关联分析

4.5 细胞转染实验

5. 实验结果与分析

5.1 血液生理生化指标的检测

5.2.转录组测序分析

5.3 Micro RNA 测序分析

5.4 miRNA-mRNA整合关联分析

5.5 运动学候选miRNA的载体构建及细胞转染

6. 讨论

6.1 训练方案的制定

6.2 血液生理生化指标的检测

6.3 转录组测序分析

6.4 miRNA测序分析

6.5 miRNA-mRNA整合关联分析

7. 全文研究的创新与展望

致谢

参考文献

作 者 简 介