绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞中enJSRV囊膜蛋白的细胞生物学作用

摘要

背景：几乎所有哺乳动物的基因组中都包含有很大一部分内源性逆转录病毒(ERVs)的基因组，而且这些E RV s在多个物种中发现。它们与胎盘发育的关系密不可分。在绵羊的基因组中至少包含有27株与外源绵羊肺腺瘤逆转录病毒(JSRV)相关的内源性逆转录病毒，这些内源性逆转录病毒被称作内源性绵羊肺腺瘤逆转录病毒(enJSRVs)。JSRV是一个可以引起绵羊发生肺癌的致癌性逆转录病毒。enJSRVs已经被发现在绵羊的生理过程中扮演了重要角色，因为它们能够阻止 JSRV的入侵和复制来保护绵羊免受 JSRV的感染，另外 enJSRVs在绵羊孕体的发育以及胎盘的形成过程中也发挥了重要的辅助作用。enJSRVs的囊膜基因在雌性绵羊生殖道和孕体中大量表达，并且它们对孕体发育以及胎盘的形成至关重要。
　　目的：在本研究中将主要聚焦到 enJSRVs囊膜蛋白在绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞发育过程中的细胞生物学作用。同时我们进一步探讨在该领域现有的争议（滋养层细胞融合的机制），并强调未来关于 enJSRVs囊膜蛋白的研究方向。
　　方法：
　　1.本研究通过酶消化法分离原代绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞(STCs)，然后应用Percoll及免疫磁珠筛选的方法进行纯化 STCs。将携带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达质粒利用电转染的方法转染到纯化后的 STCs内，来建立永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞(hTERT-STCs)。
　　2.本研究利用反转录PCR技术从STCs中扩增出完整的enJSRV-env基因及其受体 Hyal2基因序列，并通过分子克隆的手段定向插入真核表达载体 pEGFP-C1中。同时对STCs的电转染条件进行了优化以及 STCs的电转效率进行了测定。针对enJSRV-env基因我们设计并构建了具有靶向关系的 RNA干扰质粒。并将这些 RNA干扰质粒转染到能稳定表达 enJSRV-env基因的 STCs中，然后通过荧光定量PCR以及Western blot的方法检测其干扰效率。
　　3.本研究将构建好的真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/ Hyal2分别通过电转染，转染到 STCs中，在荧光显微镜下观察 enJSRV囊膜蛋白及其受体 Hyal2的瞬时表达情况。同时检测高表达 enJSRV囊膜基因及通过 RNA干扰沉默 enJSRV囊膜基因对 STCs的细胞融合活性、侵袭性、绒毛膜促性腺激素β亚基(CG-β)、胎盘催乳素(PL)分泌量的影响。
　　4.本研究利用绵羊肺腺瘤病(OPA)病羊肺组织的RNA通过反转录PCR技术克隆完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(exJSRV-env)，并将其通过分子克隆的手段插入真核表达载体 pEGFP-C1中。构建好的 pEGFP-C1/exJSRV-env真核表达质粒利用 PCR、酶切和测序的方法进行鉴定。同时将 exJSRV囊膜基因与 enJSRV囊膜基因序列进行生物信息学对比分析。将重组质粒pEGFP-C1/exJSRV-env通过脂质体法转入293T细胞内，观察 exJSRV囊膜蛋白在293T细胞中的表达及定位的情况。同时将重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/ exJSRV-env分别转染到NIH3T3细胞内，在显微镜下观察转染后的 NIH3T3细胞是否产生转化灶。用软琼脂集落形成实验以及裸鼠致瘤实验分别来检测转染重组质粒pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJSRV-env的NIH3T3细胞的生长状态。将处于对数生长期的转染重组质粒 pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/exJSRV-env的 NIH3T3细胞经胰酶消化后，按照每种细胞分别接种6只裸鼠。4周后断颈处死裸鼠，分离皮下肿瘤结节，同时进行石蜡包埋和 HE染色。
　　5.从自然感染 OPA的绵羊病肺中提取高分子量 DNA。同时将高分子量的基因组 DNA利用 XbaI消化。基因组 DNA片段用两次 CHEF凝胶电泳分离。通过电洗脱回收在10kb?40kb范围的 DNA片段，连接到CopyControl pCC1BAC克隆载体上。连接反应结束后，将透析的连接产物利用基因脉冲Xcell?系统导入TransforMax EPI300感受态大肠杆菌中。最后，将大肠杆菌涂布在含有IPTG100μg/mL、氯霉素12.5μg/mL和X-gal40μg/mL的固体LB平板上并在37℃下孵育16 h。用无菌牙签挑取白色克隆放入含有80 mL LB培养基的96孔板中，在37℃下温育过夜直至培养液变浑浊。我们通过设计混合池系统并利用PCR的方法快速筛选，这样可以减少 BAC文库的筛选工作量。利用特异性的 gag，pro，pol和 env的引物来筛选 BAC文库中含有 enJSRV基因组的 BAC克隆。
　　研究结果：
　　1.本研究建立的hTERT-STCs能稳定表达hTERT基因，细胞连续传代一年并持续增殖无衰老的迹象。hTERT-STCs仍然拥有正常的STCs的生物学特性，如表达特定的细胞内标记物细胞角蛋白7(CK-7)、能分泌绵羊绒毛膜促性腺激素以及绵羊胎盘催乳素，并且持续表达enJSRVs囊膜基因。Transwell细胞侵袭性试验表明 hTERT-STCs仍然拥有类似正常的原代绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的侵袭特性。hTERT-STCs仍具有接触抑制性，在软琼脂内不能生长，同时也没有裸鼠致瘤性。
　　2.本研究成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/ Hyal2。研究发现绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞在脉冲电压150 V，脉冲时间5 ms，电击次数2次，间隔时间50 ms时电转染效率最高。重组干扰质粒 pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-1, pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-2,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-e nJSRV-env-3,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-4,pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-Negative-shRNA构建成功。荧光定量 RT-PCR检测结果发现，将正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量作为参照， pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-Negative-shRNA组及各 RNA干扰质粒组的enJSRV-env mRNA相对表达量分别为0.985±0.015、0.581±0.006、0.179±0.037、0.346±0.034和0.403±0.044。Western blot结果发现，RNA干扰沉默 enJSRV囊膜基因的 enJSRV囊膜蛋白表达量与空白和阴性对照组比较显著下降。以上实验数据充分表明 pcDNA6.2-GW/Em GFPmiR-enJSRV-env-2的干扰效率最强。
　　3.本研究发现转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒后的STCs及共转染 pEGFP-C1/enJSRV-env与 pEGFP-C1/Hyal2后的 STCs，发生细胞融合的几率增大，平均每个视野分别可以观察到增加了20.44％±7.79%和24.09%±10.65%个 STCs。转染 pEGFP-C1/enJSRV-env的 STCs的侵袭性明显增强，转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR/enJRSV-env-shRNA-2干扰质粒的 STCs侵袭性明显减弱。然而转染 pEGFP-C1/enJSRV-env, pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR/enJRSV-env-shRNA-2质粒的STCs的CG、PL分泌量差异不显著。
　　4.本研究结果发现pEGFP-C1/exJSRV-env真核重组质粒构建成功。通过对exJSRV ENV蛋白的氨基酸序列比对研究发现该ENV的CT区内包含有一个exJSRV特有的YXXM基序。通过对enJSRV ENV蛋白的氨基酸序列比对研究发现该 ENV的 CT区内没有 YXXM基序。系统进化树分析发现我们得到的 exJSRV-env基因属于 exJSRV。利用生物信息学软件对比研究 exJSRV囊膜蛋白与 exJSRV囊膜蛋白质的理化性质、功能和结构。ExJSRV ENV的亚细胞定位研究发现大量ENV出现在细胞膜上。在 NIH3T3细胞中转染 pEGFP-C1/exJSRV-env质粒后，细胞可在软琼脂中生长并产生集落，同时没有了细胞接触抑制性，在裸鼠体内可以产生肿瘤块。这些结果充分表明 exJSRV囊膜蛋白促使NIH3T3细胞恶性转化。然而在 NIH3T3细胞中转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒后，细胞不能在软琼脂中产生集落，细胞保持接触抑制性，接种裸鼠体后不能产生肿瘤结节。说明exJSRV ENV不能促使 NIH3T3细胞恶性转化。
　　5.本研究成功构建了OPA病羊肺组织基因组BAC文库，OPA病羊肺组织基因组细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC)文库有三个子文库（1：文库_10K，2：文库_25K，3：文库_40K）构成，共含有106500个克隆。我们从 OPA病羊肺组织基因组 BAC文库中随机挑取了526个白色的 BAC克隆鉴定插入片段大小，发现文库的空载率为0.38％，插入的 DNA片段以20～25kb为主。同时建立了高效快速的 PCR筛选系统。用4对 enJSRV特异性的 PCR引物进行文库筛选，并从 OPA病羊肺组织基因组 BAC文库中筛选得到了一株阳性的 BAC克隆。
　　结论：本研究中成功建立了 hTERT-STCs细胞系，它可以作为细胞模型来研究胎盘绒毛膜滋养层细胞的分泌功能、侵袭性的特点以及enJSRVs囊膜基因可能的生物学功能。同时还成功构建了真核表达质粒pEGFP-C1/enJSRV-env， pEGFP-C1/Hyal2以及pEGFP-C1/exJSRV-env，筛选出干扰效率最强的干扰质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-enJSRV-env-2。并首次发现 enJSRV囊膜蛋白可以促进 STCs发生细胞融合以及增强细胞侵袭性。另外我们成功构建了 OPA病羊肺组织基因组 BAC文库，并从 OPA病羊肺组织基因组BAC文库中筛选得到了一株阳性的 BAC克隆。

目录

声明

缩 略 语 表

1 引言

1.1 逆转录病毒

1.2 外源性和内源性逆转录病毒的分类

1.3 外源性逆转录病毒

1.4 外源性绵羊肺腺瘤病毒

1.5 内源性逆转录病毒

1.6 内源性绵羊肺腺瘤病毒

1.7 细胞永生化

1.8 细菌人工染色体基因组文库概述

1.9 研究的目的及意义

2 试验一 永生化的绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞系的建立

2.1材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

3 实验二 enJSRV-env基因的克隆、真核表达质粒的构建及其shRNA真核表达质粒的构建

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 实验三 enJSRV ENV参与绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞的融合及侵袭

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

5 实验四 enJSRV囊膜蛋白与JSRV囊膜蛋白结构和功能的对比研究

5.1 材料

5.2 方法

5.3 结果

5.4 讨论

6 试验五 OPA病羊肺组织基因组BAC文库的构建、鉴定及筛选

6.1 材料

6.2 方法

6.3 结果

6.4 讨论

7 总体结论与创新点

7.1 总体结论

7.2 创新点

致谢

参考文献

作 者 简 介