葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白及信号通路相关蛋白磷酸化表达的影响

摘要

本试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究在葡萄糖和氨基酸应激条件，二者中哪一个对细胞增殖和β-酪蛋白表达更加敏感，并探索这一过程是如何通过激活 AMPK进而抑制 mTOR信号通路来调控的。研究结果为在实际生产中科学合理的通过能量和氨基酸调控乳蛋白合成奠定基础。试验采用两因素葡萄糖（Glc:0，2.5，17.5 mmol/L）和氨基酸（AAs:0，1.03，7.2 mmol/L）的3×3二因子试验设计，以无葡萄糖无氨基酸的培养基饥饿过夜，并在此培养基基础上分别添加下列组合浓度的葡萄糖和氨基酸的九个处理组：Glc0-AAs0，Glc0-AAs1.03，Glc0-AAs7.2，Glc2.5-AAs0，Glc2.5-AAs1.03，Glc2.5-AAs7.2，Glc17.5-AAs0，Glc17.5-AAs1.03，Glc17.5-AAs7.2。
　　试验分为四个部分：试验一、主要研究了葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响。试验二、主要研究了葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞 ATP生成的影响。试验三、主要研究了葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白生成的影响。试验四、主要研究了葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞信号蛋白磷酸化水平的影响。
　　本试验研究初步得到以下结果：
　　（1）添加不同浓度组合的葡萄糖和氨基酸，检测细胞增殖12h结果发现葡萄糖或氨基酸的浓度对细胞增殖率有显著的影响（ P<0.01）。葡萄糖和氨基酸应激均会降低奶牛乳腺上皮细胞的增殖，且在葡萄糖和氨基酸降低相同的比例（85.71％）时，葡萄糖降低组的细胞活力较低，即葡萄糖较氨基酸对细胞增殖的影响更加显著。
　　（2）添加不同浓度组合的葡萄糖和氨基酸处理2h后，检测结果发现葡萄糖或氨基酸的浓度对细胞的 ATP生成量有显著的影响（ P<0.01）。葡萄糖和氨基酸应激均使奶牛乳腺上皮细胞的 ATP生成量下降，且在葡萄糖和氨基酸降低相同的比例（85.71%）时，葡萄糖降低组的细胞内 ATP含量较低，即葡萄糖较氨基酸对细胞内 ATP生成的影响更加显著。
　　（3）添加不同浓度组合的葡萄糖和氨基酸处理2h后，检测结果发现葡萄糖或氨基酸的浓度对细胞内β-酪蛋白的生成有显著的影响（P<0.01）。葡萄糖或氨基酸应激均会使奶牛乳腺上皮细胞的β-酪蛋白表达量下降，且在葡萄糖和氨基酸降低相同的比例（85.71%）时，葡萄糖降低组的细胞内β-酪蛋白表达较低，即葡萄糖较氨基酸对细胞内β-酪蛋白表达的影响更加显著。
　　（4）添加不同浓度组合的葡萄糖和氨基酸处理2h后，检测结果发现葡萄糖或氨基酸的浓度对 AMPK的磷酸化水平有显著的影响（P<0.01）。AMPK的磷酸化水平随着葡萄糖和氨基酸浓度的降低而升高。且在葡萄糖和氨基酸降低相同的比例（85.71%）时，葡萄糖降低组的 AMPK的磷酸化水平更高。
　　（5）添加不同浓度组合的葡萄糖和氨基酸处理2h后，发现葡萄糖或氨基酸的浓度对 mTOR、Raptor、S6K1和4EBP1的磷酸化水平有显著的影响（ P<0.01）。检测 mTOR、Raptor的磷酸化表达结果与 AMPK正好相反，相对来说在葡萄糖和氨基酸降低相同的比例（85.71%）时，降低葡萄糖组，mTOR、Raptor的磷酸化水平更低，且 Raptor较mTOR降低的倍数多。同样对于 S6K1和4EBP1的磷酸化水平也是随着葡萄糖或氨基酸浓度的降低而降低，且葡萄糖降低组的 S6K1、4EBP1磷酸化水平更低，S6K1较4EBP1降低的倍数更多。
　　综上所述，葡萄糖或氨基酸应激可以通过激活 AMPK进而抑制 mTOR信号通路来影响乳蛋白合成，葡萄糖的应激较氨基酸应激对乳蛋白合成的降低程度更大。

目录

声明

缩 略 语 表

1 引言

1.1.1 乳蛋白概述

1.1.2 影响乳蛋白合成的因素

1.2 乳蛋白合成调控机理

1.2.1 AMPK信号通路

1.2.2 mTOR 信号通路

1.3 能量通过信号通路对乳蛋白合成的调控

1.4 氨基酸通过信号通路对乳蛋白合成的调控

1.5 能量和氨基酸互作对乳蛋白合成的调控

1.6 研究的目的、意义及内容

1.7 技术路线

2 研究内容

2.1 葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

2.1.1 试验材料与方法

2.1.2 结果

2.1.3 讨论

2.1.4 小结

2.2 葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞 ATP 生成的影响

2.2.1 试验材料与方法

2.2.2 结果

2.2.3 讨论

2.2.4 小结

2.3 葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞 β-酪蛋白生成的影响

2.3.1 试验材料与方法

2.3.2 结果

2.3.3 讨论

2.3.4 小结

2.4 葡萄糖和氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞信号蛋白表达的影响

2.4.1 试验材料与方法

2.4.2 结果

2.4.3 讨论

2.4.4 小结

3 总体讨论与结论

3.1 总体讨论

3.1.1 氨基酸应激对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响

3.1.2 葡萄糖应激对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响

3.1.3 葡萄糖和氨基酸交互作用对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成的影响

3.2 总体结论

3.3 本文的创新点

3.4 存在的问题及今后研究的方向

致谢

参考文献

作 者 简 介