绵羊子宫内膜细胞三维培养模式的建立及17-β雌二醇对β-防御素1表达的影响

摘要

防御素是一种富含碱性氨基酸的阳离子多肽，研究表明：17-β雌二醇可诱导绵羊输卵管上皮细胞绵羊β-防御素-1（SBD-1）的表达，但是这些研究都局限在体外二维培养模式中，其与机体内细胞三维生长状态可能差异较大，因此建立绵羊子宫内膜细胞体外三维培养模式为进一步研究防御素调控机理奠定基础。
　　本研究主要是建立一种绵羊子宫内膜细胞体外三维培养体系，在此基础上应用实时荧光定量PCR技术检测体外添加不同浓度17-β雌二醇作用不同时间对绵羊子宫内膜细胞SBD-1mRNA相对表达量影响。结果表明：传统组织块培养法、胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化+组织块培养法均可以获得二维培养模式下的绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞。经比较分析，胰蛋白酶消化+组织块培养法获得的内膜上皮细胞与基质细胞较佳，可用于绵羊子宫内膜上皮与基质细胞的三维共培养。培养后的绵羊子宫内膜上皮细胞角蛋白18免疫细胞化学染色阳性，基质细胞波形蛋白染色阳性，二者生长曲线均呈S型。将获得的内膜上皮细胞与基质细胞分别接种在人工基底膜（Matrigel）、Ⅰ型鼠尾胶原与Matrigel(1：1)混合成胶、Ⅰ型鼠尾胶原三种不同的基质胶上，细胞均呈三维立体聚集生长,其中Ⅰ型鼠尾胶原存在脱胶现象，Matrigel稳定但其价格昂贵，Ⅰ型鼠尾胶原与Matrigel(1：1）混合成胶较稳定是建立绵羊子宫内膜上皮与基质细胞三维共培养模式的较佳选择。
　　应用建立的三维培养绵羊子宫内膜细胞模型,qPCR检测结果发现：17-β雌二醇可诱导并上调SBD-1表达水平且最佳浓度为10-8mol/L，两者存在浓度和时间依赖性关系。

目录

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缩 略 语 表

1 引言

1.1 绵羊β-防御素的研究

1.2 动物细胞的二维培养与三维培养

1.3 子宫内膜细胞的二维培养与三维培养

1.4 本研究的目的及意义

2 绵羊子宫内膜细胞体外二、三维培养体系的建立

2.1 实验材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验试剂

2.1.3 仪器设备

2.1.4 实验方法

2.2 实验结果

2.2.1 绵羊子宫形态学观察

2.2.2 三种培养方法获得的原代细胞比较分析

2.2.3 绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞分离纯化培养

2.2.4 绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞形态学、生长特性

2.2.5 免疫组织化学与免疫细胞化学染色鉴定结果

2.2.6 Matrigel 基质胶中绵羊子宫内膜细胞形态

2.2.7 Matrigel 与Ⅰ型鼠尾胶原(1：1)混合胶中绵羊子宫内膜细胞形态

2.2.8 Ⅰ型鼠尾胶原中绵羊子宫内膜细胞形态

2.2.9 Matrigel 基质胶中绵羊子宫内膜细胞石蜡切片形态分析

2.3 讨论

2.3.1 二维模式下原代绵羊子宫内膜细胞三种培养方法的优劣

2.3.2 三维培养模式与二维培养模式和器官培养的比较

2.3.3 不同组合的细胞外基质所构建的内膜细胞三维培养模式的差异

2.4 小结

3.1 材料与方法

3.1.1 实验材料

3.1.2 主要实验试剂

3.1.3 仪器设备

3.1.4 实验方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 三维培养的绵羊子宫内膜细胞总RNA检测结果

3.2.2 绵羊子宫内膜细胞SBD-1与β-actin基因qPCR扩增产物电泳结果

3.2.3 绵羊子宫内膜细胞SBD-1与β-actin基因标准、扩增、溶解及溶解峰曲线

3.2.4 三维培养的绵羊子宫内膜细胞SBD-1基因测序结果

3.2.5 17-β雌二醇对三维培养的子宫内膜细胞SBD-1表达的影响

3.3 讨论

3.4 小结

4 结论

致谢

参考文献

附录

作 者 简 介