人热休克蛋白gp96基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达与纯化

摘要

热休克蛋白gp96是热休克蛋白90家族成员,在细胞内质网中含量丰富.gp96作为分子伴侣,除了具有帮助蛋白折叠和组装的功能之外,还可以引起多种免疫反应.gp96多肽复合物经抗原呈递细胞内吞后可将抗原肽交叉呈递给Ⅰ类MHC分子,从而引发机体CTL反应,产生针对该抗原的细胞免疫.同时gp96可以促进抗原呈递细胞的成熟以及细胞因子的分泌而提高天然免疫反应.得到大量高纯度的蛋白质是研究开发gp96的关键.已证实,从癌症细胞和病毒感染细胞中分离出的gp96样品,能够诱发癌症特异性或病毒特异性免疫,免疫原性主要归因于它结合的多肽.但是,通常gp96在细胞中的表达量很低,从有限的细胞或组织中分离到的gp96样品很难满足开展研究和应用的需要.因此,该实验的目的就在于体外获得大量较纯的人gp96.在我们的研究中,通过RT-PCR得到了人gp96基因,随后将它克隆到pET30-a(+)质粒载体上,并在大肠杆菌Blstar菌株中表达重组体.由于重组人gp96在大肠杆菌中表达时极容易降解,并在一定条件下形成多聚体.所以通过超速离心、硫酸氨沉淀,在经过镍柱亲和层析、ConA Sepharose亲和层析以及离子交换柱凝胶过滤层析后,除掉了大部分的污染片段和多聚体,得到了一定量的可溶性gp96,从而为我们对gp96进一步研究打下良好的基础.

目录

引言

一材料和方法

1材料

1.1菌株和质粒

1.2主要试剂和仪器

2方法

2.1重组子的克隆

2.2全长gp96的表达

2.3gp96的纯化

2.4Western检测gp96

二结果与分析

1gp96基因的表达

2Ni柱金属螯合层析纯化gp96蛋白

320QE阴离子交换柱纯化gp96蛋白

4分子筛纯化人的gp96

5纯化后gp96的Western检测和SDS-PAGE

三讨论

参考文献

四文献综述

参考文献

发表文章

致谢