DNA甲基化和组蛋白修饰调节牛ZAR1基因表达的研究

摘要

合子阻滞因子1(ZAR1)是卵母细胞特异的母性效应基，在胚胎早期发育的母型合子转变中起重要作用。牛ZAR1是单拷贝基因，位于第六号染色体，基因全长4126 bp，编码序列为1487bp，具有四个外显子，3个内含子，包含1155bp的开放阅读框，编码387个氨基酸的前体蛋白。该蛋白具有在进化上保守的植物同源结构域PHD，表明ZAR1具有转录调节的作用，DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶可能通过PHD等结构域抑制基因转录。ZAR1基因编码区有大量的回文序列，能够形成茎环结构和十字结构从而改变DNA构象，也可能直接和蛋白质相互作用。短回文序列具有核受体的DNA结合域，调节核受体的表达。该基因3'非翻译区含有UGUA序列和多聚脱腺苷化元件，与ZAR1蛋白的翻译有关。ZAR1在小鼠卵巢中特异表达，在睾丸中不表达，ZAR1-/-小鼠可以存活，但却是不育的。ZAR1-/-小鼠在卵巢发育、卵母细胞发生和受精后的早期阶段虽然正常，但大多数来自ZAR1-/-雌性的胚胎都阻滞于合子期，约有少于20%的胚胎到达2细胞期，但不能发育到4细胞。牛ZAR1在多种组织中表达，如心脏、睾丸、卵巢、骨骼肌，在胚胎发育不同阶段也有表达，有关该基因表达调控的表观遗传学机制还未见报道。本研究利用RT-PCR，亚硫酸盐测序PCR(PCR，BSP)、染色质免疫共沉淀(ChIP)，等实验技术对成年牛组织中ZAR1基因表达情况及该基因5'调控区的DNA甲基化和组蛋白修饰进行了研究，并利用实时定量PCR方法检测该基因在牛卵母细胞及体外受精胚胎中的mRNA表达的动态变化。主要研究内容如下：
　　 ⑴利用RT-PCR检测成年牛心脏、肾脏、肝脏及睾丸中ZAR1基因mRNA的表达。结果显示ZAR1基因具有组织特异性表达：ZAR1基因在睾丸中表达较高，肾脏和心脏较低，肝脏中未检测到表达。
　　 ⑵DNA甲基化是调控基因表达的一种方式，主要发生在CpG位点的胞嘧啶的第5个碳原子上，DNA甲基化并不改变基因的碱基序列，而是通过调节基因的表达影响其功能。本试验选定ZAR1基因5'调控区中的11个CpG位点，以亚硫酸盐处理的基因组为模板，进行PCR并测序，检测CpG位点的甲基化状态，结果显示：心脏中的甲基化程度明显高于其他三种组织，说明该调控区DNA甲基化与牛ZAR1基因的组织特异性表达相关。
　　 ⑶利用染色质免疫共沉淀方法对成年牛组织中ZAR1基因5'调控区的H3乙酰化、H3K9甲基化状况进行了检测。结果显示在检测的组织中心脏组织H3乙酰化程度较高，肝脏中较低。H3乙酰化较高可能与ZAR1在心脏中有表达相关；肝脏中乙酰化程度较低可能与肝脏中未检测到ZAR1的表达相关。本试验中没有在四种组织中检测到H3K9甲基化，H3K9甲基化与基因沉默相关，这一结果与ZAR1基因在所检测的牛的几种组织中的广泛表达相一致。有研究表明H3K9甲基化最主要作用靶标是卫星簇和编码区，而不是编码蛋白基因的启动子区，本研究所检测的调控区可能不是H3K9甲基化的主要修饰位点。
　　 ⑷研究基因mRNA表达的方法有Northern杂交、实时荧光定量PCR及基因芯片等多种方法，其中实时荧光定量PCR技术不仅能进行初步定量研究，且与常规PCR相比特异性和灵敏性更强。本试验采用实时荧光定量PCR方法检测了ZAR1在牛卵母细胞成熟过程中五个时期(GV、PMI、MI、AI-TI、MII)的mRNA表达状况。ZAR1在生发泡和第一次减数分裂前中期表达量较高且有显著差异，而在第一次减数分裂中期、末期和第二次减数分裂中期表达量较低且没有显著差异。
　　 ⑸ZAR1是胚胎发育的关键基因之一，检测ZAR1的表达状况为其功能研究提供一些依据。本试验应用实时荧光定量PCR方法检测了牛体外受精胚胎中ZAR1基因的表达状况。研究结果表明ZAR1在2-细胞、4-细胞、8-细胞中表达量较高，且有显著差异，而在桑椹胚和囊胚中表达量较低，且无显著差异。
　　 ⑹ZAR1是卵母细胞特异性母性效应基因，在胚胎早期发育的母型合子转变中起重要作用。本研究表明牛ZAR1基因的表达具有组织特异性，在心脏、肾脏、睾丸中有表达，肝脏中未检测到。对ZAR1基因5'调控区的DNA甲基化和组蛋白修饰的研究结果表明二者与ZAR1的组织特异性表达调控相关。ZAR1在牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育中的表达具有动态变化，生发泡期表达量较高，随着减数分裂的进行表达量逐渐降低。值得注意的是，与MII期相比2-细胞期的ZAR1 mRNA水平明显升高，推测可能与母型合子转变有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

实验部分 第一章 DNA甲基化影响牛ZAR1基因表达的研究

引 言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

参考文献

实验部分 第二章 组蛋白修饰影响牛ZAR1基因表达的研究

引 言

材料与方法

1 材料

2 方法

结 果

讨论

参考文献

实验部分 第三章 ZAR1基因在牛卵母细胞和体外受精胚胎中的表达

引 言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

参考文献

结论

附 录

文献综述 母型合子转变研究进展

致谢

攻读学位期间发表的论文