马、驴和骡成纤维细胞培养、核型及其G带分析研究

摘要

本研究以马、驴、骡为材料,利用体外培养技术构建了马、驴、骡的成纤维体细胞系,然后采用常规染色体标本制作技术,制备、分析并比较了其染色体组型。在此基础上尝试了制备马、驴、骡染色体G带标本制备的最佳条件,并完成马、驴、骡染色体G带对比分析。本研究为马、驴、骡细胞遗传学研究和疾病诊断提供技术基础,同时为进一步阐明马、驴的亲缘关系及其种间杂交的生殖调控提供了基础遗传学资料。
　　 实验结果如下:
　　 1.成纤维体细胞系的构建:
　　 实验结果说明常规的细胞系构建和培养方法宜适用于马、驴和骡成纤维细胞,培养时所用培养液为DMEM,血清含量为10％,培养温度为37.5℃,CO2浓度为5％。传代时用DPBS冲洗细胞,用0.25％的胰蛋白酶／EDTA消化,传代比例为1:3,3～4天更换培养液。
　　 2.染色体标本及G带标本制作:
　　 通过常规染色体制备方法,可以制备出较好的马、驴和骡染色体标本。本实验将马、驴、骡细胞在终浓度为0.067μg／ml秋水仙素的培养液中培养3.5h,0.075mol／L KCl低渗处理32min,固定液以甲醇:冰醋酸以3:1体积比配置,预固定和固定时间分别为1min、30min,固定2次。滴片后用终浓度为0.076％的Giemsa染液染色处理10～15min。本研究制备染色体G带标本时总结出两种较好的方法:标本老化法和直接显带法。标本老化法须将染色体标本(未染色)老化3～7d,70℃烤片2h,标本用0.125％胰蛋白酶溶液处理1min20s后用0.85％氯化钠溶液漂洗2次,由Giemsa染液染色处理10-15min。直接显带法无需将标本老化,滴片后80℃烤片1～2h,0.01％胰蛋白酶溶液处理时间为2min30s～2min50s,Giemsa染液处理10min左右。本试验采用直接显带法制备了一系列马属动物染色体G带标本。
　　 3.染色体核型分析结果:
　　 结果显示马的染色体数目为2n=64,驴的染色体数目为2n=62,骡子的染色体数目为2n=63,上述结果与之前研究报道的数目相符。马、驴染色体形态特征也与以前的学术报道结果基本一致。不育骡子的一半染色体形态结构特征与马的单倍染色体形态结构特征相似,另一半染色体形态结构特征与驴的单倍染色体形态结构特征相似。而可育母骡除个别染色体与马、驴染色体形态结构特征相似外,其余己不能分辨出马、驴的染色体结构,而且部分染色体可能配对。
　　 4.染色体G带分析结果:
　　 马、驴、骡染色体G带明暗相间,每个物种染色体均显示了独特的带纹特征,马与驴的每对染色体G带特征无一相同。不育母骡、不育公骡的染色体G带特征差别不大,但是与可育母骡的染色体G带特征却有明显不同。不育母骡、不育公骡与马、驴的大多染色体G带特征相同,但不育母骡的H1,H2,H6,H7,H18,H19,H21号及D2～4,D11,D14,D16,D19,D23,D27号染色体和不育公骡的H2,H4,H10,H17,H21,H30,HX及D1,D3,D4,D5,D9,D11,D12,D16,D27染色体分别与之所对应的马、驴染色体G带特征有所不同。可育骡子除部分染色体属于典型的马或驴的染色体外,大多数染色体带型与马、驴的染色体带型不一致,不能明显区分其源于马或驴。
　　 5.结论和推测:
　　 实验说明常规细胞培养方法可用于马、驴、骡子的成纤维体细胞培养和建系。马的染色体数目为2n=64,驴的染色体数目为2n=62,骡子的染色体数目为2n=63。染色体核型和G带分析研究结果证明。不论是不育和可育骡子,其一半染色体形态结构特征与马的单倍染色体形态结构特征相似,另一半染色体形态结构特征与驴的单倍染色体形态结构特征相似。但是,可育母骡除个别染色体与马、驴染色体形态结构特征相似外,其余已很难分辨出马、驴的来源,说明其已经发生了染色体内或染色体间的重排或互换,推测这种染色体的内部结构变化可能与骡子的可育性存在着某种关联。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

一、马属动物的染色体核型及其带型研究简介

(一)马属动物的概况

(二)染色体核型分析及带型技术简介

(三)马属动物染色体的研究

二、马、驴、骡成纤维细胞的分离、培养和传代

(一)材料与方法

(二)结果与分析

(三)讨论

三、马、驴、骡常规染色体标本的制备

(一)材料与方法

(二)结果与分析

(三)讨论

四、马、驴、骡染色体G带标本的制备

(一)材料与方法

(二)结果与分析

(三)讨论

五、马、驴、骡染色体核型分析

(一)材料与方法

(二)结果与分析

(三)讨论

六、马属动物染色体G带分析

(一)材料与方法

(二)结果与分析

(三)讨论

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的论文