溶血磷脂酰胆碱对血管平滑肌细胞的增殖作用及其信号通路

摘要

目的：研究溶血磷脂酰胆碱(LPC)对人血管平滑肌细胞的增殖作用,并阐明其受体介导信号转导机理。
　　 内容培养的人大动脉平滑肌细胞,用LPA和LPC及LPA受体特异性拮抗剂Ki16425和Gi蛋白特异性抑制剂PTX刺激2-3d,MTT比色法观察AoSMCs增殖;实时荧光定量PCR分析LPA受体和Autotaxin的基因表达量;采用蛋白印迹技术检测血管平滑肌细胞在受到L,PA、LPC、Ki16425和PTX刺激后,观察ERK1/2在磷酸化程度上的差别。
　　 结果： MTT法显示LPA、LPC均能促进AoSMCs增殖,且Ki16425和PTX均能抑制它们的增殖作用。荧光定量RT-PCR结果表明,在AoSMCs细胞中,LPA1-5五个受体均有表达,其中LPA1受体的表达量远远高于其它几个受体。Autotaxin基因在血管平滑肌细胞中大量表达,并且显示出很高的磷脂酶D活性,使LPC转化为LPA。Western blot结果表明,用LPA、LPC和PDGF单独刺激AoSMC细胞均能使ERK1/2信号通路活化。与Ki16425同时作用和PTX预处理AoSMC细胞时,LPA和LPC诱导的p-ERK1/2水平明显降低,而PDGF诱导的ERK1/2磷酸化水平未受影响。
　　 结论：1)研究首次发现,血管平滑肌细胞本身表达的Autotaxin参与由LPC刺激细胞的增殖作用。在细胞和细胞培养液中均检测到Autotaxin的蛋白表达和磷脂酶D的活性。2)LPC在胞外通过LPC-LPA1和LPC-LPA-LPA1两种途径激活血管平滑肌细胞LPA1受体,在血管平滑肌细胞内LPC促细胞增殖的信号转导途径是LPA1-Gi-ERK。3)ox-LDL及其中的LPC是引起动脉粥样硬化的重要因子,并控制血液中的ox-LDL浓度对预防和治疗动脉粥样硬化有重要的意义。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

1.引言

2.材料与方法

2.1 细胞培养

2.1.1 试剂和仪器

2.1.2 细胞培养常用试剂及溶液的配制

2.1.3 实验过程及步骤

2.2 细胞增殖实验(MTT法)

2.2.1 试剂和仪器

2.2.2 原理

2.2.3 MTT法测定细胞增殖实验步骤

2.3 荧光定量PCR测定mRNA表达量

2.3.1 试剂和仪器

2.3.2 测定原理

2.3.3 试剂的配制

2.3.4 荧光定量PCR实验步骤

2.4 ATX酶活性测定

2.4.1 试剂和仪器

2.4.2 原理

2.4.3 试剂的配制

2.4.4 活性测定步骤

2.5 Western blot检测

2.5.1 试剂和仪器

2.5.2 Western blot溶液的配制

2.5.3 Western blot实验步骤

2.6 统计学处理

3.结果与分析

3.1 AoSMC细胞的形态及一般的生物学特性

3.2 LPC对血管平滑机细胞增殖的影响

3.3 LPA受体在血管平滑机细胞(AoSMCs)中的表达

3.4 Autotaxin酶活性的测定

3.4.1 Autotaxin的基因表达

3.4.2 蛋白表达

3.4.3 活性测定

3.5 LPC对ERK途径的活化

4.讨论

4.1 LPC的细胞外代谢

4.2 受体偶联G蛋白的鉴定

4.3 细胞内的信号通路

5.结论

参考文献

致谢

综述:脂蛋白及其中的生理活性磷脂与动脉粥样硬化之间的关系

攻读硕士学位期间发表的学术论文和参加的研究项目