利用转基因技术创建紫花苜蓿耐盐新种质的研究

摘要

作物生长、产量和质量受土壤盐渍化限制,已成为世界上的一个普遍问题。紫花苜蓿(Medicago Sativa L.)是一种优良的豆科牧草,蛋白质含量高,维生素和矿物质含量丰富,氨基酸种类齐全,且适口性好,在我国北方地区的农牧业生产和生态建设中发挥极其重要的作用。然而,多数紫花苜蓿品种耐盐能力差,不合适在盐碱地种植。因此,培育合适在盐碱地种植的耐盐丰产的紫花苜蓿新品种,充分利用盐碱地,提高牧草产量,是发展农牧业经济和改善生态环境的有效途径。现代生物技术育种的迅速发展,为培育新的品种提供了高效快捷的方法。
　　 本研究选择紫花苜蓿阿尔冈金品种为材料,通过转基因技术对其进行了耐盐性遗传改良,获得了耐盐性提高的新种质。主要研究结果如下:
　　 1、对紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期和苗期的耐盐性分析,结果表明225mmol／L和300 mmol／L的NaCl浓度分别是发芽期和苗期耐盐性筛选的适合浓度。
　　 2、利用花粉管通道法将盐生植物红树(Rhizophora apiculata L.)总DNA导入紫花苜蓿,获得12株耐盐性强的植株。以供体和受体为对照,对12株耐盐植株进行RAPD分析,条带的差异性表现为新增条带、供体特异条带和受体条带丢失。分析引物S178和引物S198在植株Ms-ra3中出现的供体特异条带和新增条带序列,初步证实外源DNA已经整合到受体的基因组中,而且T0代植株耐盐能力提高可能与外源基因的导入有关。移栽T0代耐盐植株至实验地,人工辅助同株自交授粉,获得T1代种子。225 mmol／L NaCl筛选获得T1代幼苗,T1代幼苗经300 mmol／L NaCl胁迫后测定耐盐相关生理生化指标,结果表明T1代植株耐盐性明显增强。T2代幼苗经0.6％NaCl胁迫处理21 d,获得了T2代耐盐株系。
　　 3、比较分析了培养基成分(MS培养基、UM培养基、SH培养基)和激素配比对阿尔冈金品种下胚轴、子叶和子叶节再生的影响,发现子叶节在添加3.0mg／L6-BA的SH培养基上适宜遗传转化,生根培养时添加0.5mg／L IBA。在此基础上,本研究通过农杆菌介导法首次将盐生植物盐角草(Salicornia europaeaL.)Na+／H+逆向运输蛋白基因SeNHX1导入阿尔冈金,PCR检测获得36株T0代转基因植株,移栽温室培养获得6株生长旺盛的植株。RT-PCR检测显示SeNHX1基因在5个转基因植株中获得了表达。0.6％NaCl胁迫表达外源基因的5个转基因植株扦插苗后测定耐盐相关生理生化指标,结果表明这5个转基因植株的多数耐盐相关生理生化指标均优于对照,而且有1个转基因植株(MseNHX75)所测定耐盐相关生理生化指标均优于其他转基因植株。加代培养获得T1代植株,经PCR鉴定筛选获得了T1代转基因株系。
　　 4、首次克隆了紫花苜蓿阿尔冈金盐诱导表达基因MsPRP2启动子序列,大小为1521 bp,与GenBank中报道的序列(AF028841)的同源性为93.7％,且含有2个大的AT富含区和1个G-box。成功构建了盐诱导型启动子驱动SeNHX1基因的植物双元表达载体pPZP221(MsPNN),并利用农杆菌介导法转化紫花苜蓿阿尔冈金,获得转化再生植株。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 盐生植物及植株耐盐性研究进展

1.2.1 盐生植物

1.2.2 盐胁迫对植物的毒害

1.2.3 植物耐盐机理

1.2.4 植物耐盐相关基因

1.3 导入总DNA耐盐育种研究进展

1.3.1 花粉管通道法技术的提出与建立

1.3.2 花粉管通道法的可行性与分子证据

1.3.3 导入总DNA耐盐育种

1.4 紫花苜蓿耐盐育种研究进展

1.4.1 紫花苜蓿耐盐杂交育种

1.4.2 紫花苜蓿耐盐基因工程研究

1.5 本研究的目的和意义

第二章 用花粉管通道法导入红树总DNA创建紫花苜蓿耐盐新种质

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 红树基因组DNA的提取

2.1.3 外源DNA的导入

2.1.4 紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期耐盐性分析

2.1.5 紫花苜蓿阿尔冈金品种苗期耐盐性分析

2.1.6 T0代植株的盐胁迫筛选

2.1.7 耐盐性T0代植株DNA的提取

2.1.8 RAPD分析

2.1.9 RAPD条带的序列分析

2.1.10 T1代种子获得

2.1.11 T1代耐盐性植株获得

2.1.12 T1代耐盐性植株相关生化指标分析

2.1.13 T2代种子盆栽耐盐筛选

2.2 结果与分析

2.2.1 红树基因组DNA的提取

2.2.2 外源DNA的导入

2.2.3 T0代种子获得

2.2.4 紫花苜蓿阿尔冈金品种种子发芽期耐盐性分析

2.2.5 紫花苜蓿阿尔冈金品种苗期耐盐性分析

2.2.6 T0代植株耐盐性筛选

2.2.7 耐盐性T0代植株DNA的提取

2.2.8 RAPD分析

2.2.9 RAPD条带的序列分析

2.2.10 T1代种子获得

2.2.11 T1代耐盐性植株获得

2.2.12 T1代耐盐性植株耐盐相关生化指标分析

2.2.13 T2代种子盆栽耐盐筛选

2.3 讨论

第三章 转化Na+/H+逆向转运蛋白基因创建耐盐紫花苜蓿新种质资源

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 SeNHX1基因的PCR扩增

3.1.3 表达载体的构建

3.1.4 pPZP221(35SNN)质粒转化农杆菌AGL1

3.1.5 农杆菌介导pPZP221(35SNN)转化紫花苜蓿阿尔冈金

3.1.6 转化植株的鉴定

3.1.7 T0代转基因植株的移栽及扦捅扩繁

3.1.8 T0代转基因植株的耐盐相关生理生化指标分析

3.1.9 T1代转基因种子的获得

3.1.10 T1代转基因株系的获得

3.2 结果与分析

3.2.1 SeNHX1基因的扩增

3.2.2 快速提取质粒法筛选重组子pPZP221(35SNN)

3.2.3 PCR鉴定重组子pPZP221(35SNN)

3.2.4 重组质粒载体pPZP221(35SNN)酶切鉴定

3.2.5 重组表达载体pPZP221(35SNN)测序鉴定

3.2.6 转化农杆菌AGL1鉴定

3.2.7 农杆菌介导pPZP221(35SNN)外植体

3.2.8 不定芽的获得及生根培养

3.2.9 转化植株的鉴定

3.2.10 T0代转基因植株的移栽及扦插

3.2.11 T0代转基因植株的耐盐相关生理生化指标分析

3.2.12 T1代转基因种子的获得

3.2.13 T1代转基因株系的获得

3.3 讨论

第四章 盐诱导表达基因MsPRP2启动子的克隆及其驱动SeNHX1基因转化紫花苜蓿的研究

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 引物设计

4.1.3 MsPRP2启动子PCR扩增

4.1.4 连接反应

4.1.5 重组子转化

4.1.6 快速提取质粒法筛选重组子

4.1.7 重组子PCR鉴定

4.1.8 重组子酶切鉴定及测序分析

4.1.9 表达载体构建

4.1.10 pPZP221(MsPNN)质粒冻融法转化农杆菌AGL1

4.1.11农杆菌AGL1介导pPZP221(MsPNN)转化紫花苜蓿

4.2 结果与分析

4.2.1 MsPRP2启动子PCR扩增

4.2.2 快速提取质粒法筛选重组子

4.2.3 重组子PCR鉴定

4.2.4 重组子酶切鉴定

4.2.5 重组子测序分析

4.2.6 表达载体构建

4.2.7 转化pPZP221(MsPNN)再生植株的获得

4.3 讨论

结论

参考文献

致谢

发表及已录用的论文