尖孢镰刀菌高产纤维素酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化

摘要

本文对实验室保藏的121株尖孢镰刀菌(形态学鉴定)进行了产纤维素酶的研究,通过初筛复筛得到了了5株纤维素酶的高产菌株。对所得菌株进行了ITS序列鉴定和粗酶液酶学性质分析,并进行了发酵产酶条件的优化。
　　 通过刚果红染色观察水解圈的方法从121株尖孢镰刀菌(形态学鉴定)中初步筛选出20株酶活较高的菌株。从初筛得到的20株菌种通过粗酶液酶活测定和酶活力计算,筛选出纤维素酶活力最高的5株菌,其中H57-1酶活力达到16.41U／ml。
　　 对筛选出的5株菌进行ITSrDNA序列测定。测序结果利用www.NCBI.nlm.nih.gov中BALST软件,与Genbank数据库进行序列比对分析,结果显示5株菌均与尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum Schlech)亲缘关系最近,相似性达99％。
　　 对菌株H57-1的粗酶液酶学性质进行了分析。以CMC-Na为底物,其最适反应条件为PH=5.3,62℃。该酶具有良好的pH稳定性和温度稳定性,尤其作为真菌对强碱环境的耐受能力,一定程度上能弥补真菌纤维素酶耐碱性差和细菌纤维素酶酶活低的不足。
　　 对菌株57—1最适产酶发酵条件进行了优化。以麸皮48.0g／L、蛋白胨14.0g／L、磷酸二氢钠2.0g／L、氯化铵3.9g／L、氯化钠2.0g／L、pH7.0配制发酵培养基,取3mL种龄48h的种子液接种发酵培养基,温度28℃、摇床转速150r／min振荡培养85h,最终酶活力达到23.19U／ml,比初始酶活力提高了41.3％。

目录

文摘

英文文摘

绪论

1.1 纤维素酶的分类

1.2 纤维素酶的分子结构

1.3 纤维素酶的降解机制

1.4 纤维素酶的来源

1.5 纤维素酶的应用

1.5.1 在食品工业中的应用

1.5.2 在饲料工业中的应用

1.5.3 在洗涤剂纺织工业中的应用

1.5.4 在造纸脱墨工艺中的应用

1.6 纤维素酶高产菌株的选育

1.6.1 传统育种

1.6.2 基因工程育种

1.7 纤维素酶的发酵工艺

1.8 纤维素酶的分离提纯

1.9 纤维素酶活力测定方法

1.9.1 滤纸酶活

1.9.2 外切葡聚糖酶活力测定方法

1.9.3 内切葡聚糖酶活力测定方法

1.9.4 β-葡萄糖苷酶活力测定方法

1.10 尖孢镰刀菌

1.11 尖孢镰刀菌产纤维素酶研究

1.12 本研究的意义

一、纤维素酶高产菌株的筛选

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

1.1.2 主要试剂与药品

1.1.3 主要仪器与设备

1.1.4 培养基和试剂配制

1.2 方法

1.2.1 初筛方法

1.2.2 复筛方法

1.3 结果与分析

1.3.1 初筛

1.3.2 葡萄糖标准曲线的绘制

1.3.3 水解圈直径均值与酶活力的相关性分析

1.3.4 复筛

1.3.5 小结

二、菌株的ITS序列鉴定

1.1 材料

1.1.1 菌种

1.1.2 主要试剂与药品

1.1.3 主要仪器与设备

1.1.4 培养基和试剂配制

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

1.2.2 ITS rDNA序列的PCR扩增

1.2.3 PCR产物的胶回收

1.2.4 胶回收产物与pMD19-T载体的连接

1.2.5 感受态细胞的制备

1.2.6 连接产物转化感受态细胞

1.2.7 转化克隆的筛选与鉴定

1.2.8 ITS rDNA序列分析

1.3 结果与分析

三、菌株57-1的酶学性质分析

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

1.1.2 主要试剂与药品

1.1.3 主要仪器与设备

1.1.4 培养基和试剂配制

1.2 方法

1.2.1 酶的最适作用pH测定

1.2.2 酶的最适反应温度测定

1.2.3 酶的pH稳定性

1.2.4 酶的温度稳定性

1.3 结果与分析

1.3.1 酶的最适作用pH

1.3.2 酶的最适反应温度

1.3.3 酶的pH稳定性

1.3.4 酶的温度稳定性

1.3.5 小结

四、菌株57-1发酵产酶条件的优化

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

1.1.2 主要试剂与药品

1.1.3 主要仪器与设备

1.1.4 培养基和试剂配制

1.2 方法

1.3 结果与分析

1.3.1 碳源对产酶的影响

1.3.2 氮源对产酶的影响

1.3.3 三因素响应面优化

1.3.4 磷酸盐对产酶的影响

1.3.5 无机盐对产酶的影响

1.3.6 培养基起始pH对产酶的影响

1.3.7 接种量对产酶的影响

1.3.8 种龄对产酶的影响

1.3.9 温度对产酶的影响

1.3.10摇床转速对产酶的影响

1.3.11菌株发酵产酶曲线

1.3.12小结

五、结论和展望

参考文献

附录

致谢

硕士研究生期间发表论文