普氏原羚——牛异种动物克隆研究

摘要

普氏原羚(Procapra przewalskii)，亦称普氏小羚羊，是世界上最濒危物种之一，为中国特有珍惜濒危物种。属偶蹄目、牛科、羚羊亚科、原羚属动物，历史上曾分布于内蒙古、甘肃、宁夏和青海。它形态大小与藏原羚相似，曾被看作是藏原羚的一个亚种，实为独立种。本研究以普氏原羚的成体细胞作为核供体，以牛的卵母细胞作为受体胞质，进行异种克隆操作，探讨普氏原羚异种克隆的可行性。从青海野生动物园的一只健康成年普氏原羚的耳源部采得约0.5cm2的组织1块，经体外培养后，得到成纤维细胞。从细胞水平对普氏原羚体细胞培养、生长曲线测定、核型制备与分析、细胞周期、转染条件的优化等方面进行了较为系统的研究。从屠宰场收集牛卵巢，采得卵丘卵母细胞复合体，经体外培养后，获得成熟卵母细胞。使用去乙酰化酶抑制剂处理异种重构胚，采用常规体细胞核移植技术和改进后的反向核移植技术，观察了普氏原羚异种克隆胚的发育情况。结果如下：
　　 1、普氏原羚成纤维细胞培养在38.5℃，CO2浓度为5.0％的条件下，经过0.5％血清饥饿处理2天，当细胞的汇合度为50％-60％，70％-80％，95％-100％时，G0/G1期细胞的百分比分别为77.03％，77.51％和92.25％。长满后(接触抑制使细胞大部分处于G0/G1期)的体细胞与血清饥饿处理的体细胞在进行核移植时，效果是一致的。细胞成梭型长条状或不规则多角形、边缘清晰。经细胞冷冻、复苏后，细胞活力无明显改变。细胞的染色体数目为60条，但是随着培养代次的增加，染色体的非整倍性会逐渐增加，表明体外培养系统会对细胞染色体倍性产生一定影响。用脂质体介导的红色荧光蛋白(pDS-Red2)和Oct-4-eGFP转染普氏原羚成纤维细胞，最佳的转染条件是15μl Lipfectamine LTX及4μg质粒DNA的转染体系。
　　 2、分别以不同浓度的去乙酰化酶抑制剂Valproi cacid(VPA)对普氏原羚-牛异种重构胚处理不同时间，观察克隆胚胎的发育。结果表明，0.5mM的VPA处理24h可以显著提高克隆胚胎8-16细胞的发育率(61.9％vs50.7％)。但是，与未处理的对照组相比，异种克隆胚胎的桑椹胚和囊胚发育都没有显著性差异(1.2％vs1.6％，P>0.05；0.8％vs1.6％，P>0.05)；用0.5mM的VPA处理转基因细胞来源(Oct-4-eGFP)的异种重构胚，观察异种重构胚的发育。结果表明，经VPA处理24h后，试验组与对照组在卵裂率(78.4％vs71.4％)、8-16细胞发育率(62.1％vs58.5％)、桑椹胚发育率(1.3％vs1.9％)和囊胚发育率(0.7％vs1.3％)等方面均没有显著差异(P>0.05)；用30nM的TrichostatinA(TSA)处理重构胚24h，观察异种重构胚的发育情况。TSA处理组在各个时期显著高于对照组，囊胚率也得到明显提高(3.6％/3.0％vs0.8％/0.9％，P<0.05)，获得3枚表达绿色荧光的转Oct-4-eGFP的普氏原羚一牛的异种克隆囊胚；通过反向核移植法进行异种核移植操作，观察异种重构胚的发育情况。结果表明，在卵裂率(61.1％vs63.5％)和8-16细胞发育率(45.6％vs49.0％)上没有显著性差异，实验组得到1枚囊胚；为了探索普氏原羚-牛的异种克隆胚胎发育低的问题，本研究还对异种重构胚、受体卵母细胞、供体细胞、牛-牛同种克隆胚胎等进行了芯片检测。结果显示，与供体细胞、卵母细胞相比，8-16细胞期异种重构胚激活643个基因，而8-16细胞期牛克隆胚胎激活了1527个基因。异种重构胚只激活了部分与重编程相关的基因。与牛体细胞相比，普氏原羚体细胞中有1010个基因没有被有效沉默。提示异种来源的供体细胞在核重编程过程中进行的不彻底。
　　 以上结果表明，虽然牛的卵母细胞质可以支持普氏原羚体细胞发生重编程，异种重构胚可以发育到囊胚，但是囊胚发育率均很低。利用VPA处理重构胚未能提高囊胚发育率；而TSA处理重构胚明显提高了囊胚发育率；异种囊胚能够表达重编程因子Oct-4。组学分析初步表明，异种重构胚只能激活部分与重编程相关的胚胎发育基因，供体细胞的基因还在持续表达，母源性mRNA在异种重构胚降解可能受到阻碍。