质子感知受体TDAG8在酸性环境中提高肿瘤细胞存活与转移的一种新机制

摘要

众所周知，肿瘤细胞微环境是酸性的;肿瘤在酸性环境中存活、转移与其复杂的调控机制密切相关。尽管一些研究（包括我们）证明，质子感知受体TDAG8(T-死亡相关基因8，GPCR65)在酸性环境中提高肿瘤细胞存活能力，但其详细的分子机理仍然不明。我们本次研究中发现，酸性刺激肿瘤细胞TDAG8表达提高，TDAG8受酸性（质子）刺激被激活后促进MCT1(Monocarboxylatetransporters1)、MCT4(Monocarboxylatetransporters4)和CD147表达;MCTs增强肿瘤细胞的排酸能力，防止酸性诱导的细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞在酸性环境中存活与迁移能力。本研究首次揭示了质子感知受体TDAG8诱导单羧酸转运体（Monocarboxylatetransporters，MCTs）表达的一个崭新功能，阐述TDAG8的该功能与肿瘤细胞在酸性环境得以存活与转移能力之间关系及其信号转导机制，对肿瘤在酸性环境中存活与转移方面找出了新的理论依据。另一方面，TDAG8及其诱导MCTs的信号通将为肿瘤治疗战略中提供新的思维。
　　本文将研究过程分为四部分描述:
　　第一部分过表达TDAG8基因的A549-TDAG8细胞系的建立
　　目的:首先克隆人TDAG8基因，构建TDAG8基因真核表达载体、并建立稳定过表达TDAG8基因的转基因细胞系。方法:从人胃癌组织总RNA中反转录PCR法克隆TDAG8基因，亚克隆到pEASY-T1载体，通过测序、酶切、连接到真核表达载体pIRES2-EGFP，酶切、测序鉴定获得pIRES2-EGFP-TDAG8重组质粒;pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-TDAG8表达载体以lipofectamine2000TM转染A549细胞。在荧光显微镜下观察荧光，G418筛选之后获得转基因细胞系A549-TDAG8和A549-Vector。RealtimePCR和WesternBlot检测TDAG8基因在转基因细胞中的表达。结果:测序和酶切的结果显示真核表达载体pIRES2-EGFP-TDAG8已获得，筛选到A549-Vector细胞系和A549-TDAG8细胞系以及检测到TDAG8基因在A549细胞中成功表达。结论:成功克隆人TDAG8基因、构建真核表达载体pIRES2-EGFP-TDAG8，获得稳定过表达TDAG8基因的转基因A549-TDAG8细胞系。
　　第二部分TDAG8通过促进MCT1、MCT4和CD147的表达增强A549细胞在酸性条件下存活与迁移的研究
　　目的:检测质子感知受体TDAG8在酸性条件下激活后对肿瘤细胞存活与迁移能力的影响。方法:用MTT实验和划痕实验分别检测A549-TDAG8细胞和A549-Vector细胞在酸性条件下的存活与迁移能力。WesternBlot检测MCT1、MCT2、MCT4和CD147在A549-TDAG8细胞中的表达。结果:在酸性条件下A549-TDAG8细胞的存活与迁移显著高于A549-Vector细胞;然而MCTs抑制剂显著抑制上述作用。A549-TDAG8细胞在酸性条件下促进MCT1、MCT4和CD147的表达，然对MCT2的表达没有影响。结论:TDAG8在酸性条件下诱导MCT1、MCT4和CD147的表达，从而提高肿瘤细胞酸性条件下的存活与迁移能力。
　　第三部分TDAG8诱导MCT1、MCT4和CD147表达的信号通路研究
　　目的:TDAG8诱导MCT1、MCT4和CD147表达信号通路研究。方法:ELISA检测A549-TDAG8细胞cAMP积累，MTT和划痕实验检测信号分子抑制剂对A549-TDAG8在酸性条件下存活与迁移的影响，WesternBlot检测A549-TDAG8细胞MCT1、MCT4、CD147、PKA、PKC、NF-κB和Sp1的表达。结果:H89、Staurosporine、BAY11-7082和MithramycinA抑制A549-TDAG8细胞在酸性条件下存活与迁移;H89和BAY11-7082抑制酸性诱导A549-TDAG8细胞MCT1和MCT4的表达，H89、Staurosporine和MithramycinA抑制酸性诱导的A549-TDAG8细胞CD147的表达。H89和Staurosporine抑制酸性诱导A549-TDAG8细胞NF-κBp65磷酸化和Staurosporine抑制酸性诱导A549-TDAG8细胞Sp1的磷酸化。结论:在酸性条件下TDAG8促进肿瘤细胞的MCT1、MCT4和CD147的表达从而增强肿瘤细胞在酸性条件下存活与迁移能力。cAMP-PKA-NF-κBp65信号通路参与A549-TDAG8细胞MCT1和MCT4的表达，cAMP-PKA/PKC-Sp1信号通路参与A549-TDAG8细胞CD147的表达。
　　第四部分TDAG8基因对肿瘤形成的影响
　　目的:检测TDAG8基因对肿瘤形成的影响。方法:已获得的真核表达载体pIRES2-EGFP-TDAG8和pIRES2-EGFP用lipofectamine2000TM转染到LLC细胞，G418筛选阳性细胞。MTT实验检测在酸性条件下LLC-TDAG8细胞和LLC-vector细胞中的存活，WesternBlot法在LLC-TDAG8细胞和LLC-vector细胞中检测MCT1、MCT4和CD147表达。LLC-TDAG8细胞和LLC-vector细胞分别注射BL/C57小鼠体内，观察肿瘤形成情况以及WesternBlot法在肿瘤组织中检测MCT1、MCT4和CD147的表达。结果:酸性条件下LLC-TDAG8细胞存活能力显著增强，MCT1、MCT4和CD147表达显著提高。在活体实验中，LLC-TDAG8细胞注射后形成的肿瘤体积显著增大，MCT1、MCT4和CD147的表达水平都显著提高。结论:在肿瘤模型中TDAG8促进MCT1、MCT4和CD147的表达并促进肿瘤的生长。
　　综合结论
　　1.TDAG8诱导MCT1和MCT4表达，其信号通路为H+/TDAG8-Gs-cAMP-PKA-NF-κBp65-MCT1/MCT4;
　　2.TDAG8诱导CD147表达增加，其信号通路为H+/TDAG8-Gs-cAMP-PKA/PKC-Sp1-CD147;
　　3.酸性（H+）可以诱导TDAG8受体表达增加;因此，TDAG8诱导MCT1、MCT4和CD147的表达与肿瘤细胞的抗酸性和细胞存活与转移能力提高有密切关系。

目录

声明

摘要

英文缩略词

引言

第一章 过表达TDAG8基因的A549-TDAG8细胞系的建立

第一节 人质子感知受体TDAG8基因的克隆与克隆载体构建

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

第二节 人质子感知受体TADG8基因真核表达载体构建

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

第三节 检测A549细胞中TDAG8基因的过表达

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果分析

3．4 实验结果

第四节 讨论

第五节 小结

第二章 TDAG8通过促进MCT1、MCT4和CD147的表达增强A549细胞在酸性条件下存活与迁移能力的研究

第一节 A549细胞培养与细胞生长曲线

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果分析

1．4 实验结果

第二节 在酸性条件下TDAG8转基因细胞的存活与转移能力的检测

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果分析

2．4 实验结果

第三节 在TDAG8转基因细胞中MCT1、MCT4和CD147的表达检测

3．1 实验材料

3．2 实验方法

3．3 结果分析

3．4 实验结果

第四节 讨论

第五节 小结

第三章 酸性促进A549-TDAG8细胞MCT1、MCT4和CD147表达的信号通路研究

第一节 TDAG8提高肿瘤细胞的MCT1、MCT4和CD147的表达细胞内信号通路检测

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果分析

1．4 实验结果

第二章 讨论

第三节 小结

第四章 TDAG8基因对肿瘤形成的影响

第一节 稳定转染TDAG8基因LLC细胞系的建立与MCT1、MCT4和CD147表达检测

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 结果分析

1．4 实验结果

第二节 TDAG8对肿瘤形成的影响与肿瘤组织中MCT1、MCT4和CD147表达检测

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果分析

2．4 实验结果

第三节 讨论

第四节 小结

第五章 全文总结

文献综述

综述一 TDAG8介导的细胞内信号转导机制与功能

综述二 单羧酸转运体在肿瘤中的功能

附录

参考文献

致谢

在校期间完成的学术论文与参与的科研项目