左旋咪唑体外调节树突状细胞诱导Th1型免疫应答的分子机制初探

摘要

左旋咪唑(LMS)作为佐剂，能够诱导抗原呈递细胞产生炎性因子和上调共刺激分子CD80和CD86的表达，但对于左旋咪唑如何加强Th1细胞免疫的细胞学基础及其分子机制仍未确定。那么左旋咪唑作佐剂是否通过TLRs介导的信号通路调控树突状细胞的成熟，从而产生诱导Th1型细胞因子的微环境，从而增强Th1型免疫应答，到目前尚未见此方面的相关研究报道。因此，本项目拟对左旋咪唑佐剂在提高机体细胞免疫尤其是Th1型细胞免疫应答的机理作一探索。
　　以DC表面的TLRs为靶位，研究左旋咪唑佐剂与DC相互作用的效应，并在此基础上探讨二者相互作用的受体和信号转导机制，旨为佐剂作用的机理研究和新型疫苗研制和应用提供新的资料。
　　首先使用骨髓来源细胞因子(GM-CSF、IL-4)诱生法培养树突状细胞，LMS刺激细胞后，采用光学显微镜观察法、流式细胞术及ELISA法，分别观察细胞形态、检测细胞表面分子及细胞因子，对树突状细胞进行鉴定;其次采用MTT法检测LMS刺激成熟的树突状细胞诱导脾脏Na(i)ve T细胞活化增殖效应，并通过ELISA法检测树突状细胞、T细胞共培养上清中IFN-γ、IL-4的分泌量来初步确定T细胞分化方向;最后通过Real-time PCR、Western blotting检测LMS刺激成熟树突状细胞表面TLR2、4、6、9，并且通过抑制剂试验进一步确定TLRs，之后Real-time PCR、Western blotting检测信号通路中下游信号接头分子MyD88及核转录因子NF-B来确定LMS刺激DC成熟信号通路。
　　结果如下:1、体外成功培养出小鼠骨髓来源树突状细胞前体细胞，在LMS刺激下可大量表达表面特异性分子(CD11C、MHC-Ⅱ)和共刺激分子(CD80和86)并且高表达细胞因子IL-12p70，由此证明左旋咪唑可以在体外诱导DC成熟。2、体外试验证实LMS刺激成熟的DC可以诱导Na(i)ve T细胞活化增殖，ELISA检测活化的T细胞大量分泌IFN-γ而IL-4的分泌量基本无变化，初步表明成熟的DC诱导Na(i)ve T细胞向Th1型细胞分化。3、Real-time PCR、Western blotting检测LMS刺激成熟DC高表达TLR2，anti-TLR2处理DC前体细胞后再使用LMS刺激IL-12p70表达量显著下降，由此证明LMS刺激未成熟DC成熟有TLR2的参与。4、左旋咪唑通过TLR2激活树突状细胞成熟后，信号通路接头分子MyD88及转录因子NF-B的表达均上调，由此证明LMS刺激未成熟DC成熟有TLR2介导的信号通路的参与。本研究将为进一步揭示左旋咪唑刺激未成熟树突状细胞成熟机理提供理论指导。

目录

声明

摘要

缩略词表

文献综述

第一章 左旋咪唑佐剂对树突状细胞成熟及其抗原提呈功能的促进作用的影响

1．1 材料

1．1．1 主要仪器设备

1．1．2 动物

1．1．3 主要试剂及耗材

1．1．4 主要溶液配制

1．2 方法

1．2．1 树突状细胞前体细胞的获得

1．2．2 流式细胞法检测LPS刺激树突状细胞前体细胞48h后DC表面分子表达率

1．2．3 流式细胞法检测左旋咪唑刺激树突状细胞前体细胞24h后DC表面分子表达率

1．2．4 流式细胞法检测左旋咪唑刺激树突状细胞前体细胞48h后DC表面分子表达率

1．2．5 流式细胞法检测左旋咪唑刺激树突状细胞前体细胞72h后DC表面分子表达率

1．2．6 ELISA检测1μM左旋咪唑刺激成熟的树突状细胞IL-10、IL-12p70的表达

1．3 结果

1．3．1 树突状细胞培养结果

1．3．2 流式细胞法检测LPS刺激树突状细胞前体细胞48h后DC表面分子表达率

1．3．3 流式细胞法检测左旋咪唑刺激树突状细胞前体细胞24h后DC表面分子表达率

1．3．4 流式细胞法检测左旋咪唑刺激树突状细胞前体细胞48h后DC表面分子表达率

1．3．5 流式细胞法检测左旋咪唑刺激树突状细胞前体细胞72h后DC表面分子表达率

1．3．6 ELISA检测1μM左旋咪唑刺激DC前体细胞48h检测培养上清中IL-10、IL-12p70的表达水平

1．4 讨论

第二章 左旋咪唑刺激成熟的DC对诱导Na?ve T细胞活化、增殖以及Th1型免疫应答的影响

2．1 材料

2．1．1 主要仪器设备

2．1．2 动物

2．1．3 主要试剂及耗材

2．1．4 主要溶液配制

2．2 方法

2．2．1 混合淋巴细胞反应

2．2．2 ELISA检测同种异体DC、T细胞混合培养上清中IFN-γ、IL-4的表达水平

2．2．3 统计学分析方法

2．3 结果

2．3．1 混合淋巴细胞反应

2．3．2 ELISA检测同种异体DC、T细胞混合培养上清中IFN-γ、IL-4的表达水平

2．4 讨论

第三章 左旋咪唑对DC表面Toll样受体表达的影响

3．1 材料

3．1．1 主要仪器设备

3．1．2 细胞

3．1．3 主要试剂与耗材

3．1．4 主要溶液配制

3．2 方法

3．2．1 Real-time PCR检测左旋咪唑对DC表面Toll样受体表达影响

3．2．2 Western Blotting检测左旋咪唑对DC表面Toll样受体蛋白表达影响

3．2．3 抑制细胞表面TLR2后ELISA检测左旋咪唑刺激成熟的DC IL-10、IL-12p70的分泌

3．2．4 统计学分析

3．3 结果

3．3．1 Real-time PCR检测左旋咪唑对DC表面Toll样受体表达影响

3．3．2 Western Blotting检测左旋咪唑对DC表面Toll样受体蛋白表达影响

3．3．3 抑制细胞表面TLR2后ELISA检测左旋咪唑刺激成熟的DC的IL-10、IL-12p70分泌

3．4 讨论

第四章：研究左旋咪唑佐剂通过TLR2激活DC诱导Th1免疫应答的信号转导机制

4．1 材料

4．1．1 主要仪器设备

4．1．2 细胞

4．1．3 主要试剂与耗材

4．1．4 溶液配制

4．2 方法

4．2．1 Real-time PCR测定树突状细胞TLR2信号通路中关键街头分子和特异转录因子的表达

4．2．2W estern Blotting检测树突状细胞TLR2信号通路中关键街头分子和特异转录因子的蛋白表达

4．2．3 统计学分析

4．3 结果

4．3．1 Real-time PCR测定树突状细胞TLR2信号通路中关键街头分子和特异转录因子的表达

4．3．2 Western Blotting检测树突状细胞TLR2信号通路中关键街头分子和特异转录因子的蛋白表达

4．4 讨论

结论

参考文献

致谢

硕士期间发表学术论文