大肠杆菌TorR蛋白对基因表达和DNA复制起始的调控机制

摘要

为了揭示TorS/TorR二组分体在细胞周期中的作用，利用流式细胞仪检测了ΔtorS和ΔtorR突变体细胞的复制式样。发现ΔtorS突变细胞复制起始原点的数目和倍增时间与野生型细胞一致，而ΔtorR突变细胞复制起始原点的数目多于野生型细胞，复制起始发生的时间也比野生型细胞早。过表达TorR蛋白或者共同表达TorS和TorR蛋白都不能使ΔtorR突变体表型恢复为野生型。然而，在野生型和ΔtorR突变细胞中过表达SufD蛋白能使复制起始提早发生，相反，在ΔsufD单突变和ΔtorRΔsufD双突变细胞中复制起始延迟。另外，已知ΔtorR突变细胞中SufD表达提高。所以，TorR可能通过改变sufD基因的表达来影响DNA复制起始。
　　已知依赖于细胞周期的基因表达机制有三种:(i)转录激活与抑制因子和启动子之间的动态相互作用，(ii)关键调节因子依赖于细胞周期的累积与降解，(iii)调节因子的磷酸化与去磷酸化。本文发现大肠杆菌二组分体TorR/TorS中的应答蛋白TorR聚集成焦点(TorR focus)定位在细胞旧极。TorR焦点能够以依赖于细胞周期的方式与染色体DNA共定位，而且通过这种方式来时空调节一些基因的表达。这些基因包含Fe2+转运相关基因，肠杆菌素合成和转运相关基因和铁硫簇组装相关基因。TorR焦点的形成和旧极定位需要MreB或DnaK蛋白和与其相互作用，也需要ATP，这说明TorR的运输需要细胞骨架组织和ATP提供的能量。TorR蛋白焦点的形成、旧极定位和与MreB或DnaK的相互作用依赖于TorR信号接收结构域(SR)和应答调节结构域(RR)。缺乏蛋白之间的相互作用或者阻断ATP提供能量导致TorR失去对基因表达的调控功能。Z环(FtsZ-ring)的形成可能是TorR焦点合成的信号，以此确保每一个子细胞得到一个TorR焦点。本文发现基因表达的空间调控新机制，也就是通过限制转录因子在细胞中的空间分布来确定转录因子与靶基因相互作用的时间，从而调控靶基因依赖于细胞周期的表达。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 细菌二组分体蛋白的极性定位(文献综述)

1．1 引言

1．2 细菌的二组分体

1．3 蛋白极性定位机制

1．4 大肠杆菌中CheA-CheY／CheB二组分体蛋白的极性定位

1．5 新月柄杆菌中二组分体蛋白的动态定位

1．6 结语

第二章 大肠杆菌TorR蛋白对基因表达和DNA复制起始的调控机制

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌种与质粒

2．2．2 引物

2．2．3 实验试剂药品来源

2．2．4 主要仪器与设备

2．2．5 主要培养基及试剂的配制

2．3 实验方法

2．3．1 质粒构建

2．3．2 感受态细胞制备

2．3．3 转化

2．3．4 P1转导

2．3．5 细胞倍增时间(doubling time)的测定

2．3．6 流式细胞仪分析样品制备

2．3．7 荧光显微镜样品的制备和染色

2．3．8 基因芯片实验

2．3．9 细菌总RNA的提取

2．3．10 总RNA的纯化

2．3．11 反转录PCR

2．3．12 实时荧光定量PCR

2．3．13 定点突变

2．3．14 删除突变

2．3．15 免疫共沉淀实验

2．3．16 质谱实验

2．3．17 细菌双杂交试验

2．3．18 Miller法测定B-半乳糖苷酶活性

2．3．19 Western blot分析

2．4 实验结果

2．4．1 大肠杆菌二组分体应答蛋白TorR对DNA复制起始的影响

2．4．2 TorR蛋白对基因表达的调控依赖于细胞周期

2．4．3 TorR的旧极定位依赖于MreB和DnaK蛋白

2．5 讨论

2．5．1 TorR蛋白可能通过调节sufD基因的表达量来影响DNA复制起始

2．5．2 TorR蛋白通过与MreB和DnaK相互作用定位在细胞的旧极

2．5．3 细胞周期中确定基因表达时间的空间调控

参考文献

致谢

攻读博士期间发表的论文