绵羊脐带和羊水间充质干细胞的分离培养及鉴定

摘要

间充质干细胞(Msenchymal stem cells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs存在于动物胎儿和成体多种组织中，目前已经从多个物种的多种组织中提取分离出MSCs，而研究最多的MSCs主要是骨髓源的MSCs。
　　本研究以绵羊脐带和羊水组织为材料来源，分别采用酶消化法和离心分离法培养获得目的细胞，并大量冻存了第三代的细胞。然后，以第五代细胞为实验对象，对得到的细胞进行了形态学、生长性能、表面标志等方面的鉴定，最后，进行成脂、成骨、成软骨的诱导分化，验证其多能性。结果显示分离得到的细胞形态均一，呈现成纤维样细胞形态，增殖能力旺盛，在体外传代培养至20代时细胞仍然保持良好的生物学性状;传代至第20代时，仍具有正常二倍体核型(2n=54);免疫细胞化学检测显示细胞表达表面标记CD13、CD29、CD44、CD90和CD106，不表达造血干细胞标志基因CD45。结果表明本研究分离得到的细胞具备MSCs的生物学特性。进一步通过细胞染色及实时定量PCR技术验证了其体外诱导分化能力，结果显示:成脂诱导后，细胞经油红-O染色可见明显脂滴，RT-PCR显示成脂细胞特异性基因硬脂酰CoA去饱和酶(SCD)、过氧化物酶体增殖物激活受体G(PPARG)表达呈阳性;成骨诱导后，经AgN03染色后可见钙盐沉积，实时定量PCR显示成骨细胞特异性基因胶原蛋白Ⅰ(BGLAP)表达呈阳性;成软骨诱导后，经阿利新蓝染色后呈蓝色，PCR显示成软骨特异基因光蛋白聚糖(LUM)和双链蛋白聚糖(BGN)表达呈阳性，以上结果表明所分离的MSCs可以成功向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化。综上所述，我们成功建立了绵羊MSCs分离、纯化及鉴定平台，得到了绵羊脐带和羊水MSCs，有望用于后续研究。

目录

声明

摘要

缩略词及中英文对照表

第一章 绵羊间充质千细胞的研究进展

一、MSCs的生物学特征

1．1 MSCs的来源及定义

1．2 MSCs的表面标志

1．3 MSCs的可塑性

1．4 MSCs的免疫原性

二、绵羊MSCs的生物学特性

2．1 绵羊MSCs的来源

2．2 绵羊MSCs的表面标志

2．3 绵羊MSCs可塑性

三、绵羊MSCs的应用研究

3．1 骨缺陷的应用

3．2 瓣膜缺陷的应用

3．3 其他应用

四、存在的问题以及前景

参考文献

第二章 绵羊脐带和羊水间充质千细胞的分离培养及鉴定

一、引言

二、实验材料和方法

2．1 实验材料和仪器

2．2 实验方法

三、实验结果

3．1 形态学观察

3．2 第20代细胞核型

3．3 增殖能力检测

3．4 表面标志检测

3．5 体外多向分化能力检测

四、讨论

结论

参考文献

致谢