绵羊Izumo2的cDNA克隆、在睾丸和精子上的定位观察及与其它精卵融合相关蛋白相互作用的初步筛选

摘要

受精作用是将上一代的基因组传递给下一代，并开始一个新生命体生长的细胞机制的总和。在哺乳动物中，精卵融合是通过精子和卵子表面多种分子的相互作用完成的，但目前对这些分子的相互作用机制还不清楚。到目前为止鉴定出若干参与精卵融合的蛋白质，其中精子蛋白有IZUMO蛋白家族、CRISPs家族蛋白、SLLP1、PDIA3、TSSK6、SPESP1和EQUATORIN等，卵子上有JUNO等蛋白。现在的研究多集中在这些蛋白质之间的相互作用模式上。本研究克隆了绵羊Izumo2 cDNA序列，原核表达并纯化GST-IZUMO2融合蛋白，用纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体，研究IZUMO2蛋白在睾丸和在精子上的定位。本研究还使用酵母双杂交技术初步探究了IZUMO2与IZUMO1、IZUMO3、IZUMO4、PDIA3、TSSK6、SPESP1、SLLP1、CRISP1、MN9之间的相瓦作用。
　　以绵羊睾丸组织总cDNA为模板，根据GenBank序列(XM004015399.1)设计引物克隆绵羊Izumo2 cDNA，全长为813 bp，其中编码区为666 bp，BLAST结果显示其与GenBank数据库中的绵羊预测序列相似度为98.6％。克隆得到的绵羊Izumo2 cDNA序列编码222个氨基酸，其中从N端开始前15个氨基酸为信号肽，第186-206个氨基酸构成跨膜结构域。
　　构建原核表达质粒pGEX-Izumo2，转化E.coli BL21(DE3)感受态菌，用IPTG诱导表达了分子量约为50 kDa的GST-IZUMO2融合蛋白，并采用SDS-PAGE切胶纯化法纯化GST-IZUMO2融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备并纯化小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体。用纯化后的抗体进行免疫组织化学研究IZUMO2蛋白在睾丸和精子上的定位，结果显示IZUMO2蛋白在绵羊睾丸组织的各期细胞中均会表达;在精子发生顶体反应前IZUMO2蛋白位于精子的头部，当精子发生顶体反应后IZUMO2蛋白消失。
　　为了探寻IZUMO2蛋白与精子上的其他精卵融合相关蛋白的关系，本研究利用酵母双杂交技术初步探究了IZUMO2与IZUMO1、IZUMO3、IZUMO4、PDIA3、TSSK6、SPESP1、SLLP1、CRISP1、MN9之间的相互作用，结果未发现相互作用。

目录

声明

符号说明

摘要

一、文献综述

1 精子和卵细胞的成熟

2 精子穿透卵丘细胞层和透明带

3 精子与卵细胞膜的相互作用

3．1 参与精-卵膜相互作用的精子蛋白

3．2 参与精-卵膜相互作用的卵子蛋白

二、绵羊Izumo2 cDNA的克隆与序列分析

前言

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物组织

2．1．2 实验仪器

2．1．3 试剂与材料

2．1．4 常用试剂配方

2．2 实验方法

2．2．1 绵羊睾丸组织总RNA的提取

2．2．2 cDNA的合成与检测

2．2．3 绵羊Izumo2 cDNA的克隆

2．2．4 绵羊Izumo2 cDNA序列与蛋白结构分析

2．3 结果

2．3．1 绵羊睾丸组织总RNA的提取与鉴定

2．3．2 绵羊cDNA的检测

2．3．3 绵羊Izumo2 cDNA第一段的克隆与鉴定

2．3．4 绵羊Izumo2 cDNA第二段的克隆与鉴定

2．3．5 绵羊Izumo2 cDNA全长的克隆与鉴定

2．3．6 绵羊Izumo2 cDNA序列与蛋白结构分析

2．4 讨论

三、绵羊Izumo2原核表达载体的构建与重组蛋白的分离纯化

前言

3．1 实验材料

3．1．1 菌种及质粒

3．1．2 实验仪器

3．1．3 试剂与材料

3．1．4 常用试剂配方

3．2 实验方法

3．2．1 绵羊Izumo2原核表达载体pGEX-Izumo2的引物设计与合成

3．2．2 绵羊pGEX-Izumo2原核表达载体的构建

3．2．3 绵羊IZUMO2在大肠杆菌中的表达

3．2．4 SDS-PAGE电泳鉴定GST-IZUMO2融合蛋白

3．2．5 Western blotting鉴定GST-IZUMO2融合蛋白

3．2．6 GST-IZUMO2融合蛋白的纯化

3．2．7 考马斯亮蓝法测定GST-IZUMO2融合蛋白的浓度

3．3 结果

3．3．1 目的片段的PCR扩增与鉴定

3．3．2 过度载体pMD-Izumo2的构建与鉴定

3．3．3 原核表达载体pGEX-Izumo2的构建与鉴定

3．3．4 绵羊IZUMO2在大肠杆菌中的融合表达与蛋白纯化

3．3．5 GST-IZUMO2融合蛋白的Western blotting鉴定

3．3．6 蛋白浓度测定

3．4 讨论

四、小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体的制备

前言

4．1 实验材料

4．1．1 实验动物

4．1．2 实验仪器

4．1．3 试剂与材料

4．1．4 实验细胞

4．2 实验方法

4．2．1 小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体的制备

4．2．2 小鼠抗绵羊GST-IZUMO2腹水多克隆抗体的纯化

4．2．3 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的特异性检测

4．2．4 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的效价测定

4．3 结果

4．3．1 小鼠抗绵羊IZUMO2腹水多克隆抗体的纯化

4．3．1 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的特异性检测

4．3．2 小鼠抗绵羊IZUMO2多克隆抗体的效价测定

4．4 讨论

五、绵羊IZUMO2在睾丸及精子中的定位检测

前言

5．1 实验材料

5．1．1 实验动物

5．1．2 实验仪器

5．1．3 试剂与材料

5．1．4 常用试剂配方

5．2 实验方法

5．2．1 绵羊IZUMO2蛋白在睾丸组织中的定位检测

5．2．2 绵羊IZUMO2蛋白在顶体反应前后精子中的定位检测

5．3 结果

5．3．1 绵羊IZUMO2蛋白在睾丸组织中的定位

5．3．2 绵羊IZUMO2蛋白在顶体反应前后精子中的定位

5．4 讨论

六、绵羊IZUMO2与其它精卵融合相关蛋白相互作用的初步研究

前言

6．1 实验材料

6．1．1 菌种及质粒

6．1．2 实验仪器

6．1．3 试剂与材料

6．1．4 常用试剂配方

6．2 实验方法

6．2．1 酵母载体pGAD-Izumo2、pGBK-Izumo2的引物设计与合成

6．2．2 酵母载体pGAD-Izumo2、pGBK-Izumo2的构建

6．2．3 酵母双杂交法检验蛋白相互作用

6．3 结果

6．3．1 目的片段的PCR扩增与鉴定

6．3．2 过度载体pMD-Izumo2-AD和pMD-Izumo2-BK的构建与鉴定

6．3．3 酵母载体pGAD-Izumo2、pGBK-Izumo2的构建与鉴定

6．3．4 PCR鉴定

6．3．5 杂交结合体的鉴定

6．3．6 酵母缺陷平板生长结果

6．4 讨论

参考文献

致谢

攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文