酵母双杂交鉴定FAK与TSC2作用的功能域及TSC2磷酸化位点鉴定

摘要

粘附斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)是一种胞质非受体酪氨酸激酶，是整合素调节信号通路重要的调节因子，在细胞的迁移、粘附、侵入、分化、肿瘤干细胞的增殖与分化和肿瘤微环境形成等方面起着至关重要的作用。TSC1/2复合体(the trimeric tuberous sclerosis complex1/2)由TSC1和TSC2组成，是一个汇聚细胞内外多种信号的中心节点，对胞外有丝分裂原和生长因子，胞内能量水平、氧分压等作出回应，调节mTORC1(The mechanistic target ofrapamycin complex1)通路活性。mTOR是非典型性的Ser/Thr激酶，在细胞内与其它蛋白形成两个不同的复合体mTORC1和mTORC2而发挥作用。mTORC1是细胞生长和代谢过程中一个重要的调节枢纽，积极调控蛋白质合成和其他代谢过程的多个方面。
　　我们前期的研究显示FAK与TSC2具有相互作用关系，FAK可能通过TSC2调控mTORC1活性。为了进一步研究FAK与TSC2之间的相互作用机制，我们以人293T细胞为材料，首先利用酵母双杂交技术确定FAK与TSC2相互作用的具体功能域;次之利用RNA干扰和基因过表达技术研究细胞内FAK基因表达后沉默以及过表达对mTOR信号通路中mTOR、S6和4EBP1的活性影响情况，确定FAK对mTOR通路的调控作用;接着，将人FAK基因和TSC2基因共转到到酵母细胞中过表达，用免疫共沉淀技术确定FAK和TSC2在酵母中同样发生相互作用;最后，为了检测TSC2受FAK作用后发生变化的磷酸化位点，利用真核诱导表达技术诱导TSC2在酵母内大量表达，分离TSC2单一蛋白，利用质谱进行磷酸化组检测。
　　实验结果显示:1.酵母双杂交实验表明FAK和TSC2具有相互作用关系，全长FAK的C-末端片段FAT功能域(665-1052aa)与TSC2的N-末端hamartin功能域(aa.1-419)为二者相互作用所必需;2.人293T细胞中FAK基因转录后沉默时，phospho-FAK(Tyr397)、phospho-mTOR(Ser2448)、phospho-4EBP1(Thr37/46)和phospho-S6(Ser240/244)的磷酸化明显降低，mTOR信号通路的活性抑制;相反，FAK基因过表达时，phospho-FAK(Tyr397)、phospho-mTOR(Ser2448)、phospho-S6(Ser240/244)和phospho-4EBP1(Thr37/46)磷酸化明显增强，mTOR信号通路活性增强;3.将人FAK基因和TSC2基因共转入酵母细胞，免疫共沉淀验证了二者之间的相互作用关系;4.TSC2单一蛋白通过质谱磷酸化组检测及比对分析，TSC2的Tyr779发生了特异磷酸化，可能是受FAK作用的磷酸化位点。
　　综上所述，FAK的C-末端FAT功能域与TSC2的N-末端hamartin功能域具有相互作用关系。FAK基因转录后沉默和过表达影响mTOR通路活性，这种影响可能是通过使TSC2的Tyr779发生磷酸化而实现的。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1．1 FAK和mTOR

1．1．1 FAK及其信号通路

1．1．2 mTOR及其信号通路

1．2 FAK／mTOR信号通路

1．2．1 FAK／PI3K／Akt／mTOR信号通路

1．2．2 FAK／MAPK／mTOR信号通路

1．2．3 FAK／TSC2／mTOR信号通路

1．3 TSC2及其信号通路

1．3．1 TCS2的结构与功能

1．3．2 TSC2在mTOR信号通路中的作用

1．3．3 TSC1／2信号通路

第二章 酵母双杂交鉴定FAK与TSC2的相互作用功能域

2．1 材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 主要试剂

2．2 方法

2．2．1 人293T细胞总RNA的提取与cDNA第一链合成

2．2．2 FAK、TSC2引物设计与基因克隆

2．2．3 中间载体的构建

2．2．4 诱饵载体、靶载体的构建

2．2．5 感受态酵母的转化

2．2．6 酵母菌株阳性菌的PCR鉴定

2．2．7 重组诱饵表达质粒的毒性检测及自激活鉴定

2．2．8 酵母交配及筛选

2．3 结果

2．3．1 人FAK和TSC2基因克隆

2．3．2 中间载体的构建

2．3．3 酵母双杂交诱饵载体和靶载体构建

2．3．4 酵母菌株阳性菌的PCR鉴定

2．3．5 重组诱饵表达质粒的毒性检测及自激活鉴定

2．3．6 酵母双杂交两种阳性菌株交配结果

2．3．7 酵母双杂交筛选及相互作用片段的确定

2．4 讨论

第三章 人293T细胞中FAK基因过表达、转录后沉默对mTOR信号通路活性的影响

3．1 材料

3．1．1 细胞系

3．1．2 菌株和质粒

3．1．3 主要试剂

3．2 方法

3．2．1 人FAK基因过表达载体的构建与质粒提取

3．2．2 表达靶向FAK基因的shRNA质粒的提取

3．2．3 人293T细胞的培养与质粒的转染

3．2．4 蛋白提取

3．2．5 Western blot分析检测

3．3 结果

3．3．1 人FAK基因过表达载体的构建

3．3．2 人293T细胞的培养与质粒的转染

3．3．3 FAK过表达和FAK转录后沉默对mTOR信号通路活性的影响

3．4 讨论

第四章 FAK和TSC2基因共转酵母表达及TSC2蛋白特异磷酸化位点的鉴定

4．1 材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 主要试剂

4．2 方法

4．2．1 pGADT7-FAK、pGBKT7-TSC2质粒电转化酵母菌

4．2．2 酵母总蛋白的提取

4．2．3 免疫共沉淀

4．2．4 WB分析

4．2．5 TSC2蛋白在酵母菌中的诱导表达

4．2．6 磷酸化组鉴定FAK、TSC2相互作用的磷酸化位点

4．3 结果

4．3．1 pGADT7-FAK和pGBKT7-TSC2共转酵母菌的PCR鉴定

4．3．2 免疫共沉淀鉴定酵母中FAK、TSC2相互作用

4．3．3 TSC2蛋白在酵母菌中的诱导表达

4．3．4 磷酸化组鉴定FAK作用于TSC2的特异磷酸化位点

4．4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

附录