AID基因的表达调节及其在牛早期胚胎发育中的主动去甲基化作用

摘要

哺乳动物精子与卵母细胞融合后，基因组开始剧烈的表观遗传重编程。首先，来自父本基因组的雄原核在没有分裂的情况下迅速的去除DNA甲基化，母本基因组则随着DNA复制，发生被动DNA去甲基化。父本基因组的这种不依赖DNA复制、主动迅速的DNA去甲基化需要有DNA去甲基化酶的催化。早期胚胎发育过程中的这些DNA去甲基化及重新甲基化过程，为研究DNA甲基化对基因表达的影响以及与早期胚胎发育全能性的相互关系，提供了很好的时间窗口。
　　DNA甲基化去除的方式主要有两种，一种是DNA复制依赖，另一种就是经酶催化的主动DNA去甲基化，使5甲基胞嘧啶(5mC)直接转化为未甲基化的胞嘧啶。目前，在哺乳动物中还没有明确具有DNA去甲基化作用的物质，并且也不确定DNA主动去甲基化作用的途径。活化诱导的胞苷脱氨酶(activation induced cytidine deaminase，AID，亦称为AICDA)具有使单链DNA上的5mC和5C脱氨基为T的能力。AID因其在B淋巴细胞中产生抗体多样性的作用而被广泛认识。最近，在斑马鱼和小鼠受精过程中的研究发现AID脱氨基作用产生的T能够通过碱基切除修复(base-excision repair，BER)途径修复，从而实现其DNA主动去甲基化的作用。同时有研究表明AID是OCT4和NANOG这些多能基因启动子区DNA主动去甲基化所必需的因子。但是由于AID对5mC的脱氨基作用效率远远低于5C，因此其DNA去甲基化作用存在争议。
　　为了进一步研究AID在哺乳动物细胞中DNA主动去甲基化作用，本研究检测了AID在牛不同组织、卵母细胞及着床前胚胎中的表达调节，比较分析了不同时期卵母细胞及体外受精胚胎早期发育过程中AID基因启动子区DNA甲基化的动态变化，并通过基因过表达、基因敲减技术和DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR的处理，系统的研究了AID在重编程过程中的作用及其对胚胎发育的影响。
　　1.牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化
　　本研究首先通过检测AID基因在牛4种组织中的表达和其启动子区的DNA甲基化状态的变化，确定了AID基因的组织依赖分化特异性DNA甲基化调节区(tissue-dependent and differentially methylated region，T-DMR)位于其基因编码区(coding sequence，CDS)上游-88 bp～-431 bp。AID基因的表达具有组织特异性，睾丸组织的表达水平明显高于心脏、肾脏和肝脏;而睾丸组织AID基因T-DMR区的DNA甲基化程度较其它3种组织低，结果表明，AID基因的T-DMR区的DNA甲基化状态与其表达水平相关。
　　随后，本研究检测了卵母细胞成熟过程及着床前胚胎早期发育过程AID基因的表达及其T-DMR区的甲基化状态。卵母细胞成熟过程中，从GV期到MII期AID基因逐渐积累，MII期表达量达到峰值;此时，AID基因T-DMR区的第2和第3号CpG位点的DNA甲基化有一个明显的去除过程，而其他位点都未发生变化。随着精子入卵，受精卵开始细胞分裂，AID基因的表达量急剧下降，直到8-cell时期，也即母型合子转变期，AID基因表达再次逐渐升高。在这一过程中，AID基因的T-DMR区除了第2和第3号CpG位点一直都维持未甲基化状态外，其他位点都是甲基化的状态。通过免疫荧光检测发现，从GV期卵母细胞到桑椹胚，AID蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。而囊胚时期大量的AID蛋白集中于内细胞团，这可能对内细胞团多能性的维持起重要作用。综上所述，卵母细胞成熟中积累的AID作用于受精过程，其启动子区的DNA去甲基化与AID基因的表达有关。胚胎基因组激活后AID基因的表达可能与胚胎发育有关，其作用还有待研究。
　　2.AID的DNA去甲基化作用对牛卵母细胞及体细胞核移植胚胎早期发育的影响
　　本研究利用转基因克隆技术和显微注射技术，探讨AID的DNA去甲基化作用对牛卵母细胞成熟及体细胞核移植胚胎早期发育的影响。本实验构建并获得了有功能的AID基因过表达载体pCDsRed-PbAID，使用脂质体LipofectamineTM2000转染细胞后，利用G418筛选得到5个转基因克隆，经PCR鉴定后用于转基因体细胞核移植实验。研究结果显示，AID基因的过表达不能改变转基因细胞整体的DNA甲基化，但可改变OCT4、NANOG、SOX2和CDX2的启动子区甲基化状态，从而改变这些基因的表达。利用转AID基因细胞作为供体细胞能够显著提高体细胞克隆胚胎的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率。检测转基因克隆囊胚OCT4、NANOG、SOX2的表达量，发现都有不同程度的提高。同时这些基因启动子区的甲基化状态都有所降低，说明AID的DNA去甲基化作用具有位点特异性。
　　为分析AID基因在牛卵母细胞成熟及体外受精胚早期发育过程中的作用，以AID基因mRNA作为设计模板设计了三条AID基因的干扰片段，并利用显微注射的方法在GV期注入牛卵母细胞，敲减后AID基因的表达量下降到26.7％。注射后AID基因表达量的降低并未影响牛卵母细胞的成熟率和体外受精胚胎的发育率，但是AID基因的敲减改变了OCT4、NANOG、SOX2的表达量和其启动子区的甲基化状态。免疫荧光检测结果显示，在注射AID干扰片段后，5-mC和5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)在受精后原核期的表达和定位都没有明显变化，提示AID的DNA去甲基化作用可能不通过5-hmC通路。上述过表达和干扰的研究表明，AID在牛的成纤维细胞和体外受精胚胎中具有去甲基化的作用，但AID的去甲基化作用不是全基因组的DNA去甲基化而是有选择性地针对特定基因位点，如OCT4、NANOG和SOX2等基因的特异性DNA去甲基化。
　　3.DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对AID基因修饰成纤维细胞重编程的影响
　　本研究使用1、2、3、4、5μM不同浓度5-Aza-CdR处理转AID基因细胞和AID基因敲减细胞，并对细胞形态、细胞周期、多能性相关基因表达及其基因启动子区的DNA甲基化状态的变化进行了分析。结果表明，5-Aza-CdR对转基因供体细胞的影响是剂量依赖的，当浓度达到4μM时，细胞大量死亡(P＜0.05)。核型分析显示，3μM浓度组处理就可以导致转基因细胞出现异常核型。使用1μM浓度处理细胞，明显增加了表达报告基因细胞的数量，细胞AID和SOX2的表达量都有所提高，并且SOX2基因启动子区发生DNA去甲基化。5-Aza-CdR处理的AID基因敲减细胞，其OCT4和SOX2的表达量较对照组明显升高，而NANOG却没有发生变化。综上所述，5-Aza-CdR的基因组整体去甲基化与AID基因的位点特异性去甲基化对于体细胞重编程都具有重要的作用，在特定基因位点这两种作用可以相互补充，二者联合处理供体细胞可能更有利于体细胞重编程效率的提高。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 哺乳动物早期胚胎发育过程中的主动去甲基化及其机制的研究进展

前言

1 哺乳动物早期胚胎发育过程中的DNA主动去甲基化

2 哺乳动物早期胚胎发育过程中的DNA主动去甲基化机制

结语

第二章 牛早期胚胎发育中AID基因的表达及其调节区DNA甲基化的动态变化

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 AID的DNA去甲基化作用对牛卵母细胞及体细胞核移植胚胎早期发育的影响

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR对AID基因修饰的成纤维细胞重编程的影响

前言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

结论

参考文献

附录

致谢

攻读博士期间发表的论文