Piezo介导的辅助孵化对小鼠胚胎着床和发育影响的研究

摘要

透明带(zona pellucida，zP)是包裹在卵母细胞外的一层由糖蛋白组成的外被结构，在初级卵泡早期阶段由卵母细胞和颗粒细胞共同分泌形成。在受精过程和早期胚胎发育中起着重要作用。然而，透明带的厚化和硬化不利于胚胎的孵化。因此，我们尝试利用辅助孵化(assisted hatching，AH)技术提高囊胚的孵化率，从而提高胚胎的着床率以及子代的出生率。辅助孵化是通过人为的方法对透明带进行处理，使胚胎从透明带释放出的技术。目前，辅助孵化技术有许多种，我们组早期的实验发现，不同的辅助孵化技术对不同时期的胚胎进行操作会有不同的效果。Piezo介导的各种辅助孵化技术中，在桑椹胚期进行透明带打小孔处理后（打孔尺寸约为10μm），可获得最高的囊胚孵化率。而该种方法是否能够提高胚胎的着床率以及子代的出生率仍有待考究。本实验利用该种辅助孵化方法处理胚胎，再进行胚胎移植(embryo transfer，ET)，统计其胚胎着床率、母鼠妊娠率、子代出生率以及子代生长曲线等数据，以探明piezo介导的辅助孵化对小鼠胚胎着床和发育的影响。
　　本研究对以下三种不同来源的胚胎进行分析，包括:(1)自然交配组（mating组），用作非辅助孵化、非胚胎移植操作的对照组;(2)体内受精获得的胚胎，仅进行胚胎移植，而不进行辅助孵化处理，用于观察胚胎移植对妊娠效率及后代发育的影响（embryo transfer，ET组）;(3)体内受精获得的胚胎，进行辅助孵化处理后，再进行胚胎移植，用于观察辅助孵化和胚胎移植对妊娠效率及后代发育的影响（small hole，SH组）。
　　我们的研究结果表明，与Mating组相比，ET组中的胚胎移植操作会降低胚胎着床数，着床后的胚胎发育迟缓，孕天延迟，子代出生数降低，并影响子代生长曲线;但对胚移后妊娠率、活胎率、性别都没有影响。胚移后得到的子代小鼠再进行自然交配，其孕天以及生育能力没有受到影响。
　　与ET组相比，SH组虽然能够提高胚胎的体外孵化效率，但着床后胚胎发育迟缓，并影响子代生长曲线。打孔之后的胚胎在胚移之后，母鼠存活率、着床数、着床率、妊娠率、孕天、子代小鼠出生数、出生率、活胎率、性别、孕天以及子代小鼠生育能力等都没有影响。
　　SH组与Mating组相比较，会降低胚胎着床数，着床后的胚胎发育更加迟缓，孕天延迟，子代出生数降低，并影响子代生长曲线;但对胚移后妊娠率、活胎率、性别都没有影响。胚移后得到的子代小鼠再进行自然交配，其孕天以及生育能力没有受到影响。
　　综上所述，piezo介导的透明带打小孔的辅助孵化方式并不能够提高胚胎的着床率、母鼠的妊娠率和子代的出生率。相反，经过辅助孵化和胚胎移植操作后，会导致胚胎发育紊乱，对着床后胚胎的发育和子代生长曲线都有影响，但并不影响子代小鼠的性别和生殖能力。因此，我们认为，依赖于打孔方式的辅助孵化技术，在临床上应该被谨慎使用。

目录

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论文说明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 辅助孵化国内外研究进展

1．2 透明带的作用

1．3 自然孵化

1．4 辅助孵化的方法

1．4．1 机械法

1．4．2 化学法

1．4．3 激光法

1．4．4 piezo显微操作法

1．5 辅助孵化的意义

1．6 早期胚胎着床位点的观察

1．7 诱导母鼠假孕的不育公鼠

1．7．1 通过腹壁接近输精管

1．7．2 通过阴囊接近输精管

1．8 用于假孕的受体母鼠

1．9．1 输卵管内胚胎移植

1．9．2 子宫内胚胎移植

1．10 展望

第二章 实验研究

2．1 引言

2．2．1 实验动物

2．2．2 实验设备

2．2．3 实验试剂

2．3．1 桑椹胚的采集

2．3．2 辅助孵化的处理

2．3．3 胚胎移植

2．3．4 注射染料观察早期胚胎着床位点

2．3．5 生长曲线的测量

2．3．6 数据统计分析

2．4．1 胚胎移植后母鼠存活率

2．4．2 母鼠着床数、着床率以及着床后胚胎尺寸

2．4．3 母鼠妊娠率

2．4．4 母鼠孕天率

2．4．5 子代小鼠出生数及出生率

2．4．6 子代小鼠活胎率

2．4．7 子代小鼠性别比例

2．4．8 子代小鼠的生长曲线

2．4．9 子代小鼠的孕天率

2．5 讨论

参考文献

附录

致谢