D4Mille调控小鼠雌性配子成熟及早期胚胎发育的机理研究

摘要

研究背景:随着环境的恶化和生活节奏与方式的改变，世界范围内人类生殖的能力下降早已成为国际社会共同关注的问题，不孕不育症已然成为世界医学界亟待解决的重要难题。尽管人类辅助生殖技术(Assisted ReproductiveTechnology, ART)为不孕不育症患者带来了福音，但诸如卵母细胞体外成熟率及受精率低、配子染色体异倍性高;胚胎发育潜能低下等问题，仍是造成早期胚胎流产或后代出生缺陷的主要原因。在卵母细胞减数分裂成熟过程中，染色体倍数减半是保证后代正常发育的关键因素之一。大量的研究表明，许多分子参与并调控了染色体和纺锤体动力学过程，这些分子发挥正常功能离不开物质运输这一重要的细胞功能。驱动蛋白是1985年发现的一类细胞内单体分子马达，它能利用三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水解所释放的能量，驱动自身及所携带的货物分子沿微管进行运动。虽然大多数驱动蛋白都具有相同的酶促反应区域，但每一种驱动蛋白都有自已独特的亚细胞定位与功能。D4Mil1e也被称作驱动蛋白家族成员1B(kinesin family member1B，KIF1B)，它作为一种重要的微管依赖性顺式分子马达，是驱动蛋白超家族重要的成员之一。在体细胞中，它主要负责线粒体等膜性细胞器及突触囊泡的胞内运输;并且作为一个潜在的肿瘤抑制因子，通过调控细胞凋亡参与多种恶性肿瘤及其他疾病的发生。
　　研究目的:本研究以小鼠卵母细胞为对象，使用体外成熟、体外受精、显微注射、蛋白免疫印迹、免疫荧光染色及染色体铺片等技术，深入地研究了D4Mil1e在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的精确表达、定位及其功能，以及它在受精后合子第一次有丝分裂时的作用。本论文系统全面地展示了卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育过程中9个连续的时期内D4Mil1e的精确定量及精细亚细胞定位情况，进一步探索出在配子、胚胎多个重要时期内，D4Mil1e与纺锤体、染色体以及线粒体的相关作用及其机理。这不仅首次全面地阐明了D4Mil1e对哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育的调控机制，更为治疗人类不孕不育症和改进辅助生殖技术提供了有价值的理论基础。
　　研究方法:
　　(1)本研究通过孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)联合人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrop，hCG)的超数排卵技术、体外受精技术(in vitro fertilization，IVE)获得GV期(germinal vesicle)、生发泡破裂期(germinal vesicle breakdown，GVBD)、第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ，MⅠ)、第一次减数分裂后-末期(anaphaseⅠ/telophaseⅠ，AⅠ-TⅠ)、第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ，MⅡ)、第二次减数分裂后-末期(anaphaseⅡ/telophaseⅡ，AⅡ-TⅡ)、原核期(pronucleus，PN)、1细胞胚胎后期(Late1-cell)、2细胞胚胎期(2-cell)，这9个连续时期的卵母细胞及早期胚胎。通过蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光染色(immunofluorescence)、激光共聚焦显微镜(laser scanning confocalmicroscope)扫描技术，检测D4Mil1e在卵母细胞成熟和早期胚胎发育各阶段的精确定量和精细亚细胞定位。
　　(2)在上述实验结果的基础上，进一步使用纺锤体干扰药物紫杉醇(taxol)和诺考达唑(nocodazole)分别处理MⅡ期卵母细胞，通过免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜扫描技术检测微管破坏后D4Mil1e的定位情况。进一步确证D4Mil1e与微管的关系。
　　(3)在确定D4Mil1e与微管蛋白有相互作用的基础上，采用特异性和稳定性更强的吗啉基寡核苷酸(Mopholino，MO)敲减方法，在GV期卵母细胞中以显微注射的方式敲减D4Mil1e，抑制D4Mil1e的mRNA翻译。通过Western blotting和免疫荧光染色技术检测其敲减效率;统计GVBD率，在解除米力农抑制4小时、8小时、12小时、16小时后分别统计第一极体(the first polar body, PB1)排放率;使用CellSens Standard软件测量中期板厚度，分析解除米力农抑制12小时、16小时后卵母细胞中纺锤体-染色体复合体(spindle-chromosome complex，SCC)动力学;使用染色体铺片技术统计染色体异倍性。
　　(4)更进一步，为验证D4Mil1e在早期胚胎发育中的作用，使用特异性MO，在合子启动有丝分裂时的PN期以显微注射的方式敲减D4Mil1e，通过Westernblotting检测其敲减效率;追踪统计后续胚胎发育情况;通过免疫荧光染色技术分析胚胎发育质量。
　　(5)为了进一步验证D4Mil1e在合子基因组激活前后(zygotic genomeactivation，ZGA)对胚胎发育的影响，我们使用冲胚技术获取体内发育的2-cell期胚胎，在合子基因组激活的2-cell胚胎阶段，首次采用“同一胚胎不同卵裂球差异敲减技术”，进一步确证D4Mil1e对胚胎有丝分裂的影响。在两个卵裂球中使用特异性MO以显微注射的方式，分别注射Ctrl MO+Ctrl MO，Ctrl MO+D4mil1eMO和D4mil1e MO+D4mil1e MO，通过免疫荧光染色技术检测纺锤体的组装和染色体的排列情况，分析胚胎发育质量，追踪统计后续胚胎发育情况。
　　(6)在已经获得MO敲减数据的基础上，为进一步确证D4Mil1e的功能，使用特异性D4Mil1e抗体，分别在GV及MⅡ期卵母细胞中以显微注射的方式，直接在蛋白水平抑制D4Mil1e的表达后，统计GVBD率，在解除米力农抑制4小时、8小时、12小时、16小时后统计PB1的排放率;使用CellSens Standard软件测量纺锤体尺寸并计算其长宽比，使用染色体铺片技术统计染色体异倍性;追踪统计受精后各时期的胚胎发育情况。
　　(7)在确证D4Mil1e的缺失导致小鼠卵母细胞和胚胎发育异常的基础上，进一步对其可能发挥功能的下游机理进行了探讨。使用特异性MO，在GV期卵母细胞中敲减D4Mil1e以介导其功能失调，通过免疫荧光染色技术和NISElements Viewer软件检测成熟卵母细胞在线粒体分布和总ATP水平上的变化。
　　研究结果:
　　(1)本研究首次全面系统的证明了D4Mil1e的定量、定位与卵母细胞成熟和胚胎发育进程均具有很高的相关性。结果首次完整地展示了在卵母细胞(GV期、GVBD期、MⅠ期、AⅠ-TⅠ期、MⅡ期)和早期胚胎（AⅡ-TⅡ期、PN期、Late1-cell期、2-cell期）连续的9个时期内，D4Mil1e的蛋白表达水平、趋势及亚细胞结构定位。western blotting结果显示，在卵母细胞最重要的GV期到2-cell胚胎期中，D4Mil1e蛋白水平呈现间期低、中期高的表达趋势。免疫荧光染色结果显示，在减数分裂和第一次有丝分裂进程中，D4Mil1e的积累显示出动态的定位模式。
　　(2)本研究进一步阐述D4Mil1e与微管动力学之间的相关性。结果显示经抑制微管解聚的药物taxol处理后，大部分D4Mil1e与异常的纺锤体共定位，少部分弥散分布于胞质;经促进微管解聚的药物nocodazole处理后，微管完全解聚，D4Mil1e随之弥散分布于胞质中。
　　(3)本研究继续揭示D4Mil1e生物学作用对卵母细胞成熟的影响及其机制。Western blotting结果显示，在GV期卵母细胞中注射D4mil1e MO后，D4Mil1e的表达量下降了81.8％（P＜0.01）;免疫荧光染色结果显示，D4Mil1e定位异常，证明该方法具有很高的敲减效率;虽然D4mil1e MO注射组卵母细胞的GVBD率不受影响;但在成熟过程中PB1的排放率显著降低;卵母细胞成熟时中期板厚度增加了2.2倍;纺锤体染色体复合体(spindle chromosome complexus，SCCs)出现成球期阻滞、纺锤体极形态改变、染色体错排的情况，且与对照组相比（成球期阻滞:3.5±1.2％，纺锤体极形态改变:9.8±1.0％，染色体错排6.3±1.7％），这些异常类型的比例分别升高至15.5±2.6％、37.1±2.0％及26.7±2.6％(P＜0.01);培养至成熟后，染色体异倍性发生率较对照组相比增加了14.4倍(control MO:2.9±1.8％,D4mil1e MO:44.6±5.2％,P＜10-5)。
　　(4)本研究揭示了D4Mil1e对合子发育有重要影响。Western blotting结果显示，在PN期合子中用MO敲减D4Mil1e后，D4Mil1e的表达量下降了74.1％（P＜0.001）;与control MO注射组相比（2-cell期:94.8±1.2％，4-cell期:81.3±7.1％，桑椹胚期:73.5±5.9％，囊胚期:57.0±7.2％），D4mil1e MO注射组2-cell期、4-cell期、桑椹胚期(Morula)及囊胚期(Blastocyst)的胚胎发育率分别下降至85.6±3.6％，27.7±3.8％，19.5±2.5％及5.7±4.4％（P＜0.05）;免疫荧光染色结果显示，在敲减D4Mil1e后，PN期合子启动第一次有丝分裂时，纺锤体的组装以及染色体的排布都发生了异常;桑椹胚期细胞数比对照组减少了56.5％;囊胚质量降低，不能形成正常的囊胚腔，胚胎发生碎片化及2-cell阻滞。
　　(5)本研究进一步通过首创的“同一胚胎不同卵裂球差异敲减技术”，证明D4Mil1e对早期胚胎发育的具有调控作用。Western blotting结果显示，在2-cell期胚胎中用MO敲减D4Mil1e后，在Ctrl MO+D4mil1e MO注射组中D4Mil1e的表达量下降了61.8％(P＜0.001)，在D4mil1e MO+D4mil1e MO注射组中D4Mil1e的表达量下降了90.8％(P＜10-4)，证明该方法所介导的敲减是高效的;Ctrl MO+D4mil1e MO注射组4-cell期、桑椹胚期及囊胚期的胚胎发育率分别下降至44.5±2.5％，35.0±2.9％及23.6±1.2％(P＜10-4)，D4mil1e MO+D4mil1e MO注射组4-cell期、桑椹胚期及囊胚期的胚胎发育率分别下降至30.9±3.2％，14.3±2.7％及8.7±0.4％(P＜10-5)，与Ctrl MO+Ctrl MO注射组(4-cell期:85.6±2.3％，桑椹胚期:77.1±1.8％，囊胚期:70.8±2.8％)相比均具有统计学差异;免疫荧光染色结果显示，在Ctrl MO+D4mil1e MO注射组中，注射D4mil1e MO的卵裂球发生明显的纺锤体异常和染色体错排;Ctrl MO+D4mil1e MO和D4mil1e MO+D4mil1eMO注射组桑椹胚期细胞数分别减少40.0％和57.2％;囊胚质量随卵裂球D4Mil1e敲减程度的加剧而显著下降。
　　(6)本研究利用抗体封闭技术进一步证明D4Mil1e生物学功能对卵母细胞成熟及胚胎发育的作用。结果发现在GV期卵母细胞中，使用D4Mil1e特异性抗体在蛋白水平抑制D4Mil1e后，虽然不影响GVBD率，但卵母细胞成熟时PB1的排放率显著下降;MⅠ及MⅡ期卵母细胞纺锤体长宽比显著下降;且SCCs出现成球期阻滞、纺锤体极形态改变、染色体错排的情况，与对照组相比（MⅠ期卵母细胞成球期阻滞:4.0±0.8％，纺锤体极形态改变:10.0±1.2％，染色体错排7.7±0.9％; MⅡ期卵母细胞成球期阻滞:2.9±1.0％，纺锤体极形态改变:8.7±2.0％，染色体错排5.8±1.5％），在MⅠ期卵母细胞中这些异常类型的比率分别升高至13.4±1.4％，30.5±1.3％及25.6±1.3％(P＜0.01)，在MⅡ期卵母细胞中这些异常类型的比率分别升高至11.0±1.3％，25.2±2.8％及21.4±2.2％（P＜0.01）;培养至成熟后，染色体异倍性发生率较对照组相比增加了6倍（IgG注射组:3.8±2.4％，D4Mil1e抗体注射组:26.6±1.3％，P＜0.01）。在MⅡ期卵母细胞中使用抗体封闭技术后，与对照组相比（2-cell期:56.3±4.1％，4-cell期:34.6±5.1％，桑椹胚期:27.9±4.2％，囊胚期:18.9±4.5％），D4Mil1e抗体注射组卵母细胞受精后的2-cell期、4-cell期、桑椹胚期及囊胚期的胚胎发育率分别下降至47.4±2.4％，19.5±1.8％，13.7±1.1％及7.3±2.5％（P＜0.05）。
　　(7)本研究进一步从能量代谢角度揭示D4Mil1e生物学功能对卵母细胞成熟的影响及其机制。结果发现在GV期卵母细胞中用MO敲减D4Mil1e后，在M期卵母细胞中，胞质中线粒体凝集现象消失，线粒体分布异常;MⅠ期卵母细胞中总ATP水平下降至0.3±0.1，与对照组（1.0±0.1）相比下降了72.0％(P＜10-3);MⅡ期卵母细胞中总ATP水平下降至0.7±0.02，与对照组（1.0±0.1）相比下降了34.0％(P＜0.01)。
　　结论:本论文首次证明:(1) D4Mil1e蛋白表达水平及其亚细胞定位与小鼠卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育进程高度相关;(2)在卵母细胞及早期胚胎中干扰D4Mil1e的功能，会导致卵母细胞减数分裂成熟失败及后续胚胎发育受损;(3)在卵母细胞中干扰D4Mil1e的功能，会导致线粒体分布异常及ATP水平下降;(4)本研究首次系统全面的阐述了D4Mil1e通过微管依赖机制在卵母细胞的纺锤体组装及染色体中板集合过程中起重要作用。为配子发生的机理和临床染色体异倍性疾病的发生提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 文献综述 驱动蛋白家族成员的研究概述及对其在雌性生殖中作用的探讨

摘要

ABSTRACT

前言

1 驱动蛋白的发现、结构、分类

2 驱动蛋白超家族成员的功能

2．1 驱动蛋白家族成员在有丝分裂中的作用

2．2 驱动蛋白家族成员的其他功能

3 D4Mille的发现、结构、表达及功能

4 与D4Mille相关的疾病

5 D4Mille的相关作用蛋白及作用机制

6 驱动蛋白家族成员在雌性生殖中的作用及展望

第二部分 实验研究

第一章 D4Mille在小鼠卵母细胞减数分裂成熟及早期胚胎发育过程中的表达及定位

摘要

ABSTRACT

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第二章 由特异性MO及抗体所介导的D4Mille功能失调对小鼠卵母细胞成熟及早期胚胎发育的影响

摘要

ABSTRACT

前言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第三章 D4Mille功能失调对小鼠卵母细胞中线粒体和ATP的影响

摘要

ABSTRACT

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

结论

论文说明

致谢

攻读博士期间发表的论文

参加会议及受邀报告

附录