兴安落叶松尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的克隆及特性分析

摘要

兴安落叶松（Larix gmelinii）为松科落叶松属的落叶乔木，是大兴安岭地区荒山造林和森林更新的主要树种。兴安落叶松木材蓄积丰富，材质优良，可为土木、建筑、装饰、装潢、造纸和化纤工业等提供原料，体现了广泛的应用价值。UDP-葡萄糖脱氢酶(UGDH)是植物多糖代谢途径中的关键酶，它催化UDP-葡萄糖（UDP-Glc）氧化生成UDP-葡萄糖醛酸酯（UDP-GlcA）进而转化生成半乳糖醛酸、木糖、阿拉伯糖、芹菜糖等半纤维素和果胶合成的前体物质。UGDH的表达丰度影响细胞壁的生物合成，进而影响植物的生长发育及材质，所以研究UGDH基因的表达调控机理具有重要意义。
　　本研究利用兼并PCR和RACE-PCR技术分离了兴安落叶松UDP-葡萄糖脱氢酶基因（命名为LgUGDH2），并对该基因的功能和表达特性进行了分析。LgUGDH2基因的cDNA全长为1795bp，包含1449bp的开放阅读框(ORF)、108bp的5'-UTR和238bp的3'-UTR，编码482个氨基酸。实时荧光定量PCR检测结果显示，LgUGDH2在兴安落叶松的根、茎、叶中均稳定表达，茎中表达量高于叶和根。为深入调查LgUGDH2的表达调控机理，利用Tail-PCR技术克隆了2091bp的LgUGDH2启动子序列，并利用GUS报告基因深入分析了LgUGDH2的表达模式。序列分析显示，该基因的启动子区域包含赤霉素、乙烯、生长素、细胞分裂素和脱落酸等植物激素应答原件，光诱导原件以及与低温、干旱等非生物胁迫相关的应答元件。GUS染色实验显示，LgUGDH2基因主要表达在茎、叶的维管组织中，与其功能相对应。为了深入研究LgUGDH2的功能和异源表达特性，构建了pBI101-LgUGDH2双元表达载体，并通过农瘤杆菌介导的花序浸染法获得了转基因拟南芥。RT-PCR和酶活性检测结果证实了LgUGDH2在转基因拟南芥中的稳定表达。超表达LgUGDH2基因拟南芥的表型分析结果显示，LgUGDH2的过量表达促进了转基因拟南芥的营养生长，提高了植株中可溶性糖的含量，增加了半纤维素和果胶的积累。结果表明，可通过对半纤维素和果胶合成路径中的关键酶UGDH进行遗传修饰调控植物的生长发育，进而有目的地改良材质。该研究成果亦为深入研究兴安落叶松LgUGDH2基因的表达调控机制，并利用该基因进行木本植物的材质改良奠定了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 研究意义

1．2．1 UGDH基因的分子特性

1．2．2 UGDH基因的表达特性

1．2．3 UGDH基因的功能研究

1．3 技术路线

第二章 实验材料及方法

2．1 实验材料

2．1．3 试剂及试剂盒

2．2 兴安落叶松UGDH2基因的克隆

2．2．1 兴安落叶松UGDH2基因片段的克隆

2．2．2 兴安落叶松LgUGDH2基因末端序列的克隆

2．2．3 LgUGDH2基因全长克隆

2．3 LgUGDH2基因生物信息学分析

2．4 兴安落叶松歇凇基因的特性分析

2．4．1 LgUGDH2基因表达模式分析

2．4．2 LgUGDH2基因启动子的克隆

2．4．3 LgUGDH2基因启动子的分析及功能预测

2．4．4 拟南芥的遗传转化、筛选、鉴定与分析

2．5 兴安落叶松UGDH2基因的功能分析

2．5．1 pBl101-LgUGDH2双元表达载体的构建

2．5．2 拟南芥的遗传转化、筛选、鉴定与分析

2．5．3 UGDH酶活性检测

2．5．4 转LgUGDH2基因拟南芥的表型分析

2．5．5 转LgUGDH2基因拟南芥中糖含量测定

2．5．6 纤维素、半纤维素、果胶和木质素含量的测定

第三章 结果与分析

3．1 兴安落叶松LgUGDH2基因的克隆

3．1．1 LgUGDH2基因片段的克隆

3．1．2 LgUGDH2基因末端序列的克隆

3．1．3 LgUGDH2基因0RF全长的克隆

3．2 LgUGDH2基因的生物信息学分析

3．2．1 LgUGDH2基因的序列分析

3．2．2 二级结构预测

3．2．3 亚细胞定位预测

3．2．4 蛋白质跨膜结构域预测

3．2．5 信号肽预测

3．2．6 保守结构域预测

3．2．7 同源性分析

3．2．8 系统进化分析

3．3 LgUGDH2基因的表达特性分析

3．3．1 LgUGDH2的表达模式分析

3．3．2 LgUGDH2基因启动子分析

3．3．3 GUS基因表达的组织化学检测

3．4 LgUGDH2基因的功能分析

3．4．2 pBI101-LgUGDH2重组载体转化农瘤杆菌

3．4．3 转基因拟南芥幼苗的筛选与鉴定

3．4．4 转LgUGDH2基因拟南芥,UGDH酶活性的鉴定

3．4．5 转基因拟南芥植株的表型分析

3．4．6 LgUGDH2转基因拟南芥可溶性及淀粉含量的测定

3．4．7 LgUGDH2转基因拟南芥纤维素、半纤维素、果胶和木质素含量测定结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢