Tβ4通过作用于JNK和Notch信号通路影响毛囊生长的机制研究

摘要

毛发对于生物体主要起到保护的作用，可用于抵御皮肤损伤、感染和脱水，也可以调节皮肤温度。毛囊作为皮肤的一种衍生物，毛发由其发育而来。β族胸腺素属于极性蛋白质分子家族。迄今为止已经发现的β族胸腺素共有15种，本文研究的Tβ4即为其中一种。有研究表明Tβ4对毛囊的生长和发育有促进作用。Notch信号通路对于毛囊生长的调控作用始于胚胎中毛囊的形成后期，待个体出生后，对于维持毛囊生长的动态平衡也有一定的作用。有实验证实Notch信号通路中关键因子缺失的小鼠毛发较细、短而且卷曲。JNK信号通路对于毛囊的调控作用表现在参与调控毛囊的生长方向，同时也参与对毛囊周期的调控。由此可知JNK信号通路和Notch信号通路对于毛囊的生长都具有重要的作用，本研究主要探索Tβ4对于毛囊的调控作用是否与上述两条信号通路相关。
　　一、Tβ4在毛囊周期中的表达
　　本实验通过对小鼠出生后2d、6d、15d和30d的皮肤进行实时定量PCR检测，检测Tβ4的mRNA表达情况，出生15d和30d小鼠的表达量较高，分别为对照组的26.9倍和48.3倍，说明在第一个毛囊周期中，Tβ4在退行期和静止期的表达量较高。
　　二、探究Tβ4与Notch和JNK信号通路的关系
　　通过以野生型小鼠和Tβ4基因敲除小鼠的皮肤组织作为样本，对于JNK信号通路和Notch信号通路相关的四个基因Grb2、MKK7、Hes5、Notch1进行实时定量PCR检测。在Tβ4敲除小鼠中与JNK信号通路相关的两个基因Grb2和MKK7的mRNA表达量分别是对照组的0.17倍和0.84倍，Notch信号通路的两个基因Hes5和Notch1的mRNA表达量分别是对照组的0.97倍、0.72倍；然后对其进行Western blot检测，四个基因分别是对照组的0.47倍、0.10倍、0.53倍、0.9倍。说明JNK信号通路受到Tβ4基因的调控，而在Notch信号通路中，它的上游基因Notch1不受Tβ4的调控，而下游的Hes5受到Tβ4的调控。
　　三、探究Notch信号通路和JNK信号通路的关系
　　本实验是为了进一步探究Tβ4和两条信号通路的上下游关系，从而进一步确定Tβ4在信号通路网络中的作用位点，分别对Notch信号通路和JNK信号通路使用相应的信号通路抑制剂（DAPT和sp600125）处理野生型的小鼠胎儿成纤维细胞。使用浓度为1μM/L的抑制剂处理细胞48h后收样，qRT-PCR法检测两条信号通路的四个基因Grb2、MKK7、Hes5、Notch1。在经DAPT处理的成纤维细胞中MKK7、Grb2、Hes5、Notch1的表达量分别是对照组的0.13倍、0.23倍、0.08倍、0.59倍，在蛋白质水平，这四个基因的相对表达量分别为对照组的0.2倍、0.14倍、0.36倍、0.08倍。在JNK信号通路抑制剂处理的成纤维细胞中MKK7、Grb2、Hes5、Notch1的相对表达量分别0.20倍、0.49倍、0.09倍、1.02倍，在蛋白质水平，这四个基因的表达量分别为对照组的0.2倍、0.14倍、0.36倍、1.04倍。结果说明JNK信号通路的两个基因位于Notch信号通路两个基因Notch1和Hes5之间，由此可以推知Tβ4的作用位点位于Notch1和MKK7之间。
　　以上实验结果证实：Tβ4在第一个毛囊发育周期的退行期和静止期的表达量最高，说明其在退行期和静止期对毛囊的调控作用最为显著。敲除Tβ4基因对于JNK信号通路的表达量有着直接的抑制作用；在Notch信号通路中，其上游基因Notch1调控Tβ4的表达，而Tβ4基因的敲除使得其下游基因Hes5的表达量下调。综上所述，Tβ4和两条信号通路的四个关键基因的上下游关系为：Notch1→Tβ4→MKK7→Grb2→Hes5。通过本研究确定了两条与Tβ4对于毛囊产生影响相关的信号通路，同时也初步确定了Tβ4在两条信号通路中的作用位点，这为进一步探索Tβ4促进毛囊生长的调控提供了实验依据。

目录

摘 要

ABSTRACT

ABBREVIATIONS

第一章文献综述

1毛囊的性质

1.1毛囊的构成

1.2毛囊形态发生的过程

1.3毛囊发育周期

2 胸腺素β4介绍

2.1胸腺素概述

2.2胸腺素β4的生物学作用

2.3胸腺素β4作用于毛囊的机制

3 JNK信号通路概述

3.1 JNK信号通路的介绍

3.2 JNK信号通路作用机制

3.3 JNK信号通路在机体中的作用

4 Notch信号通路概述

4.1 Notch信号通路的介绍

4.2 Notch信号通路的作用机制

4.3 Notch信号通路在毛囊发育过程中的作用

1引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2实验试剂

2.3方法

2.3.1实时定量PCR

2.3.1.1总RNA的提取

2.3.1.2 实时定量PCR

2.3.1.3各基因mRNA水平相对表达量的计算

2.3.2蛋白印迹法(Western Blot)检测

2.3.2.1 蛋白质的提取

2.3.2.2 Western Blot

2.3.3成纤维细胞分离

2.3.3.1取得小鼠胎儿

2.3.3.2贴壁法取得小鼠胎儿成纤维细胞

2.3.4细胞传代、冻存

2.3.5细胞增殖曲线

2.3.6细胞迁移

2.3.7细胞免疫荧光

2.3.8信号通路抑制剂处理细胞

3 结果

3.1 Tβ4在小鼠出生后第一个毛囊生长周期中的表达检测

3.2 Tβ4基因对于小鼠成纤维细胞生长的影响

3.2.1成纤维细胞的分离

3.2.2野生型细胞和Tβ4敲除小鼠的细胞生长速率和迁移的检测

3.3探究Tβ4与Notch和JNK信号通路的关系

3.3.1探究Tβ4和JNK信号通路的关系

3.3.2探究Tβ4和Notch信号通路的关系

3.3.3探究Tβ4与Notch1的关系

3.4探究Notch信号通路和JNK信号通路的关系

3.4.1抑制Notch信号通路

3.4.2抑制JNK信号通路

4讨论

结论

参考文献

致谢