趋化因子SDF-1在脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞分化过程中的作用及对次级毛乳头细胞的影响

摘要

阿尔巴斯绒山羊所产山羊绒因其优异的品质被喻为“软黄金”，具有很高的经济价值。羊绒生长过程中毛囊的周期性变化带动着粗毛和绒毛的生长、脱落、再生。研究表明，当毛囊处于生长期时，由于毛囊中各种诱导因子表达的上调而导致其周围血管密度、体积增大。而血管的生成是一个趋化因子和内在因素共同调节的级联动态过程，其中基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）就是一种重要的趋化因子。已有实验证明SDF-1处理的脂肪间充质干细胞可以快速修复受损的伤口，表明其可能在血管网的形成和组织修复过程起关键作用。本实验在脂肪间充质干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs）向血管内皮细胞（vessel endothelial cells,VECs）分化的诱导液中添加SDF-1趋化因子，观察其对诱导分化的影响及对血管生成（angiogenesis）的作用，并且探究诱导形成的血管内皮样细胞（vessel endothelial like cell,VECs-like）对次级毛乳头细胞（Secondary Hair Follicle-Dermal Papilla cell,SHF-DPC）生长状况的影响，以便为今后深入了解绒毛生长机制提供实验依据。
　　一、诱导脂肪间充质干细胞向血管内皮细胞分化
　　以ADSCs为实验材料，在诱导液中分别添加30ng/ml、50ng/ml、70ng/ml SDF-1向VECs进行诱导，分别于72h、21d对诱导形成的VECs-like进行检测发现：①诱导过程会触发细胞的死亡，并且死亡比例与诱导时间呈正相关性；细胞形态由梭形变为长纺锤形，细胞质颜色加深，核位置明显，但组间无明显差异。②对诱导72h后的VECs-like使用兔源假性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）标记后，流式细胞仪检测荧光发现：各组诱导法均能成功，但50ng/ml SDF-1为最佳条件。③诱导72h的VECs-like以CD34、VWF、CXCR4为对象进行RT-qPCR检测发现：30ng/ml SDF-1最有利于VWF的表达，为对照组的1.45倍（p<0.05）。50ng/ml和70ng/ml SDF-1对CXCR4的表达促进作用明显，分别为对照组的40.85、12.96倍。CD34的表达在50ng/ml SDF-1时最高，为对照组的1.741倍（p<0.05）。④诱导至21d时，30ng/ml、50ng/ml SDF-1对VECs-like形成特有的管状样结构的促进作用明显；同时细胞形态变化显著，细胞间纹路明显；相比于诱导前，凋亡比例约为50%左右。⑤诱导21d后的VECs-like可观察到细胞间的丝状连接而呈现出的管腔样结构。
　　二、诱导形成的血管内皮样细胞功能检测
　　对诱导24h、72h后形成的VECs-like分别使用碘化丙丁（Propidium,PI）染色法、CCK-8、Annexin V-FITC/PI双染法、划痕法对VECs-like的周期、活性、凋亡、迁移能力检测后发现：
　　①SDF-1会使细胞周期阻滞于S、G2期，50ng/ml SDF-1时，比例最高。②酶标仪连续4d检测VECs-like活性发现，各组在观察的前3d细胞活性不高，直到第4d才有所增强，且SDF-1对细胞活性无明显影响，实验组间无显著性差异。③50ng/ml SDF-1处理后VECs-like的存活率明显升高，进入早期凋亡的比例也明显降低。④对VECs-like划痕法处理后，分别在12h、24h、36h、48h进行观察，发现36h后30、50ng/ml SDF-1因子的添加明显抑制了细胞迁移的速度。
　　三、诱导形成的血管内皮样细胞对次级毛乳头细胞的影响
　　首先将诱导形成VECs-like，使用ELISA因子检测法对培养24h后的VECs培养液内相关因子含量进行检测，发现ADSCs中bFGF含量最高，其次为30ng/ml SDF-1处理组。各组PDGF、IGF-1的含量无显著性差异。50ng/ml SDF-1处理组的VEGF含量最高，0ng/ml SDF-1处理组分泌量最少。
　　其次，以培养VECs-like24h后的上清液作为SHF-DPC的培养液来评估VECs-like分泌因子对SHF-DPC的活性和增殖能力的影响时检测发现：各实验组处理活性结果趋势相同，无明显差异；在对SHF-DPC连续计数7d的过程中，SHF-DPC于第3d开始呈指数生长，并从第4d开始，VECs-like上清处理的SHF-DPC生长速度较正常培养的SHF-DPC明显加快，说明实验组上清液中成分对增殖具促有进作用。
　　再者，将诱导72h后形成的VECs-like（下室）与SHF-DPC（上室）以Transwell的方式进行共同培养24h、48h后，对SHF-DPC的Wnt/β-catenin蛋白水平检测发现：50ng/ml SDF-1的促进作用最为明显。
　　上述实验研究表明：SDF-1因子虽不能显著提高诱导效率，但在一定程度上，可以提升VECs-like的功能，提高细胞的抗凋亡能力，并且对SHF-DPC的蛋白表达和增殖能力均具有积极调控作用。

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摘 要

ABSTRACT

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缩略词表

文献综述

1 血管的生成与血管内皮细胞间的关系

2 脂肪间充质干细胞促进血管的生成

3 基质细胞衍生因子对血管生成的作用

4 血管及旁分泌因子对毛乳头细胞的影响

5 展 望

第二章 研究论文

1.1材料

1.2主要实验设备及耗材

1.3实验试剂

2.1 细胞培养液体

2.2.1 ADSCs的培养及诱导

2.2.2 血管内皮样细胞纯度检测

2.2.3 血管内皮样细胞免疫荧光

2.2.4 血管内皮样细胞总RNA的提取和RT-qPCR

2.2.5 血管内皮样细胞活性检测

2.2.6 血管内皮样细胞周期检测

2.2.7 血管内皮样细胞凋亡检测

2.2.8 血管内皮样细胞迁移能力检测

2.2.9 血管内皮样细胞分泌因子ELISA检测

2.2.10绘制次级毛乳头细胞生长曲线

2.2.11 次级毛乳头细胞活性测定

2.2.12 Western blot

2.2.13 数据统计分析

3.1 血管内皮样细胞的鉴定及观察

3.1.1 SDF-1对血管内皮样细胞形态特征的影响

3.1.2 SDF-1对血管内皮样细胞纯度的影响

3.1.3血管内皮样细胞免疫组化鉴定

3.1.4 血管内皮样细胞RNA水平的检测

3.2 SDF-1对血管内皮样细胞活性的影响

3.3SDF-1对血管内皮样细胞周期、凋亡的影响

3.4 SDF-1对血管内皮样细胞迁移能力的影响

3.5 SDF-1对血管内皮样细胞因子分泌的影响

3.6 血管内皮样细胞培养液上清对次级毛乳头细胞增殖的影响

3.7 血管内皮样细胞对次级毛乳头细胞活性的影响

3.8 血管内皮样细胞对次级毛乳头细胞蛋白表达的影响

参考文献

致 谢