大豆抗病毒基因NL(G12g132200)的筛选鉴定及功能分析

摘要

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)感染后大豆会出现叶片黄斑、卷曲及种粒斑驳等症状，从而使大豆的产量下降，造成经济损失。选育出具有抗病性的大豆株系是防治SMV最有成效的方式，而选育出抗病大豆株系的基础是鉴定出有效的抗病基因。已有研究报道Rsv1，Rsv3及Rsv4为大豆的抗性位点，但关于SMV抗性基因功能的研究却鲜有报道。本研究的目的就是筛选鉴定出对SMV具有抗性的大豆基因。此前，在烟草中发现了对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)具有抗性的N蛋白，其属于NBS-LRR(nucleotide binding site leucine rich repeat)类蛋白。大豆基因组上具有与N基因同源的319条NBS-LRR类基因。
　　本文选用对SMV敏感的合丰25大豆品系为受试植物，结合RNA-seq转录组测序技术，根据基因的差异表达及结构分析，筛选出了28条对SMV侵染响应的NBS-LRR类基因，并且对这些基因的表达量进行了qRT-PCR的验证。以大豆基因组作为模板成功克隆出其中23条NBS-LRR类基因，并顺利构建了相应的过表达载体。首先通过快速简便的本氏烟草瞬时转化系统检测这23条基因对TMV的抗性，筛选出一条对TMV具有抗性的基因，结合Wm82.a2.v1命名法及此基因的结构特点将其命名为NL(G12g132200)。NorthernBlot实验进一步证明出NL(G12g132200)对TMV的扩增具有抑制作用。随后，发现NL(G12g132200)对SMV亦具有抗性。
　　另外，有研究表明，植物激素水杨酸(salicylic acid，SA)在病原体侵染植物时会诱导病程相关蛋白(pathogensis-ralated，PR)的积累，从而使植物建立局部乃至系统获得性免疫反应。
　　因此本文也探讨了SA与SMV侵染的后NBS-LRR类基因表达的相关性。通过向大豆施加外源性的水杨酸甲酯(methyl salicylate，MeSA)，利用qRT-PCR对NL(G12g132200)等基因的表达量进行检测。结果表明，侵染SMV后，大豆中SA的水平及包括NL(G12g132200)在内的14条NBS-LRR类基因的表达量下降。而施加外源性SA后，包括NL(G12g132200)在内的10条NBS-LRR类基因表达量增加。

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