褪黑素对安格斯牛精液冷冻及体外胚胎发育的影响

摘要

精子的冷冻保存、卵母细胞的体外成熟和胚胎体外培养是人工繁育动物的技术基础。提高精子冷冻后的活力、提升体外卵母细胞成熟和体外生产胚胎质量，对动物生产有重要意义。褪黑素（melatonin，MT）主要由松果腺合成，与生殖行为和内分泌调节密切相关。褪黑素及其代谢产物可以直接清除活性氧，使谷胱甘肽的水平增加，抑制细胞内促氧化酶活性。褪黑素是减少细胞氧化损伤最有效的物质之一。本文通过在培养液中添加褪黑素，对其在精子冷冻、卵母细胞体外成熟和体外受精胚胎发育过程中的影响进行了研究。
　　结果如下：
　　1.选取3头安格斯牛（n1、n2、n3）采精，在其精液冷冻稀释液里添加不同浓度MT（0、10-3、10-4和10-5M），研究MT对精子活力、质膜完整性、线粒体膜完整性、顶体完整性以及在冷冻过程中产生的ROS水平差异。研究发现，10-3M和10-4M MT处理组对安格斯牛的精子的活力、质膜、线粒体膜完整性都有显著性提高。添加10-3M MT后，精子的顶体完整性比对照组显著提高，且使精液的ROS水平降低约2倍。因此，在冷冻精液的过程中，添加10-3M MT为最佳浓度。
　　2.研究不同浓度MT（0、10-7、10-8、10-9和10-10M）对卵母细胞成熟的影响和MT对细胞内活性氧水平的影响。与对照组相比，添加10-7M MT对卵母细胞的成熟率有显著提高，并能使ROS水平降低2.4倍。
　　3.在体外培养液中添加10-7M MT，能显著提高胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。同时，在此过程中检测8-cell的ROS水平，MT处理8-cell能使ROS水平降低1.6倍；与对照组相比，10-7M MT能显著提高在胚胎（8-cell）发育过程中的抗氧化、抗调亡基因（CAT、BCL-2）和发育相关基因（C23、MFN1）的表达，降低促调亡（Caspase-3、BAX）基因的表达。
　　综上所述，本文较为系统地研究了褪黑素对安格斯牛精液冷冻、卵母细胞成熟、体外受精以及体外胚胎发育的影响，不同浓度的褪黑素所起的作用有差异。添加10-3M MT对精液冷冻效果最佳；添加10-7M MT可以显著提高卵母细胞成熟率和受精胚胎发育率。

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摘 要

第一章文献综述

1. 精液的冷冻保存研究原理

2.1温度

2.2精液冷冻过程中的氧化作用

3. 褪黑素的功能及作用机制

3.1褪黑素的概述

3.2褪黑素的合成和释放

3.3褪黑素的作用

3.3.1褪黑素的抗氧化作用

3.3.2褪黑素与免疫调节

4. 褪黑素在家畜繁殖中的作用

4.1褪黑素对生殖的作用

4.2褪黑素与精子细胞

4.3褪黑素和卵母细胞成熟

5. 褪黑素在体外受精中的应用

褪黑素对安格斯牛精液冷冻及体外胚胎发育的影响

引 言

1.材料与方法

1.1主要试剂及耗材

1.1.1试剂

1.1.2实验器材

1.2试验试剂及配置

1.3精液的采集及冷冻

1.3.1假阴道的准备

1.3.2采精

1.3.3精液的冷冻

1.4精子质量的检测

1.4.1精液的准备

1.4.2精子活力的检测

1.4.3精子的质膜检测

1.4.4精子的线粒体膜检测

1.4.5精子的顶体完整性检测

1.4.6精子细胞内ROS的检测

1.5卵母细胞质量的检测

1.5.1卵母细胞成熟

1.5.2第一极体排出率的统计

1.5.3卵母细胞内ROS的检测

1.5.4荧光强度分析

1.6体外受精

1.6.1胚胎的体外培养

1.6.2囊胚细胞数鉴定

1.7实时定量PCR操作

1.7.1胚胎RNA提取

1.7.2胚胎RNA反转录

1.7.3荧光定量PCR

2.试验设计

2.1试验一

2.2试验二

3.1添加褪黑素对冷冻精液品质的影响

3.1.1添加MT对解冻后精子活力的相关性分析

3.1.2 MT处理对冷冻解冻后精子运动参数的比较

3.1.3 MT处理对精子活率的影响

3.1.4 MT处理对精子质膜的影响

3.1.5 MT处理对精子顶体的影响

3.1.6 MT处理对精子线粒体膜的影响

3.1.7 MT处理对精子ROS的影响

3.2 MT添加对卵母细胞成熟的作用

3.2.1 成熟液中添加MT处理后对牛卵母细胞体外成熟的影响

3.2.2卵母细胞内ROS的检测

3.3 MT添加在体外受精中的作用

3.3.1 MT对体外受精胚胎发育的影响

3.3.2体外胚胎发育过程中对8-cell ROS的检测

3.3.3 MT对体外受精8-cell相关基因发育的影响

4. 讨 论

参考文献