过表达hTβ4的hADSCs复合羊皮脱细胞真皮基质对创面愈合影响的研究

摘要

皮肤缺损是临床上最常见的疾病之一，大面积皮肤缺损会严重影响人体健康，乃至危及生命。在皮肤损伤创面修复的研究中发现：细胞治疗法可加快皮肤损伤的修复的进程，小分子多肽胸腺素β4（Thymosin beta4,Tβ4）可通过分泌抗炎性因子，促进创面修复。而经冷冻干燥处理后的羊皮脱细胞真皮基质（Acellular Dermal Matrix,ADM），可作为一种良好的细胞支架用于细胞移植。因此为提高创面愈合效率，本实验将人脂肪间充质干细胞（human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,hADSCs）过表达hTβ4基因与羊ADM进行复合，研究其对创面愈合过程的影响。
　　首先，本研究以病患手术中的废弃脂肪组织作为实验材料，将采用胶原酶消化法获得的细胞，通过干细胞相关鉴定，最终确定其为hADSCs。其次，通过电转染法将含hTβ4基因的质粒载体pEX4-hTβ4转入到hADSCs中，经RT-qPCR和Western Blot检测发现：转染后的细胞，其hTβ4基因表达显著性提高，蛋白表达量也有所提高。
　　随后，利用酶消化法制备出羊ADM，并通过MTS法检测确定羊ADM对目的细胞无毒性作用。最后，将复合有hADSCs过表达hTβ4基因的ADM以及复合有hADSCs的ADM分别覆盖于裸小鼠全层皮肤损伤创面上。并在7，14，21天提取裸小鼠的创面组织，对创面组织HE染色和新生血管分布进行观察，同时对细胞凋亡基因和创面愈合相关基因和蛋白的表达进行检测。结果显示：随愈合时间增长，参与创面修复相关的基因VEGF和CollagenⅠ的表达量均逐渐降低，基因CK18和CollagenⅢ表达量逐渐升高，同时hADSCs过表达hTβ4基因复合羊ADM可显著性提高创面愈合速率，减少细胞凋亡，促进创面修复相关基因和蛋白的表达。
　　本研究初步探讨了转染人Tβ4基因的hADSCs复合羊ADM对于创面愈合的影响，为后续深入研究创面修复机制提供了一定的依据。

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脂肪干细胞在组织工程领域中的研究进展（文献综述）

1ADSCs的生物学特征

1.1ADSCs的形态

1.2ADSCs的免疫表型及多向分化潜能

2ADSCs在组织工程中的应用进展

2.1ADSCs在皮肤创伤愈合过程中的应用

2.2ADSCs在骨组织工程中的应用

2.3ADSCs在神经组织工程中的应用

2.4ADSCs在肝脏疾病治疗中的应用

2.5ADSCs在其他方面的应用

3 ADSCs的临床应用

4问题及展望

hADSCs过表达hTβ4细胞系的制备及其鉴定

1引言

2实验材料与溶液配制

2.1实验材料

2.2主要仪器与设备

2.3主要实验试剂和耗材

2.4实验材料

3实验方法

3.1hADSCs的培养

3.1.1hADSCs的分离及原代培养

3.1.2 hADSCs传代

3.1.3 hADSCs的冻存

3.1.4 hADSCs的复苏

3.2细胞计数

3.3 hADSCs的鉴定

3.3.1细胞形态学观察

3.3.2 MTS法检测hADSCs的增殖能力

3.3.3免疫荧光染色检测hADSCs表面标记蛋白

3.3.4 hADSCs多向分化能力检测

3.3.4.1 hADSCs体外诱导分化

3.3.4.2 hADSCs体外诱导分化细胞染色检测

3.4 转染hTβ4的hADSCs的制备

3.4.1 大肠杆菌感受态转化

3.4.2 去内毒素质粒大量提取

3.4.3脂质体转染法

3.4.4 Lonza 电转法

3.5 hTβ4-hADSCs与hADSCs RNA提取

3.6 RNA反转录为cDNA

3.7细胞蛋白提取

3.8 Western Blot

3.8.1制胶

3.8.2上样跑胶

3.8.3转膜及检测

4实验结果

4.1hADSCs的培养

4.2 hADSCs增殖能力的检测

4.3 hADSCs的表面标志蛋白检测

4.4 hADSCs多向分化能力检测

4.5转染pEX4-hTβ4质粒载体于hADSCs中

4.5.1 脂质体转染法将hTβ4基因转入hADSCs中

4.5.2 电转染法将hTβ4基因转入hADSCs中

4.6 hADSCs转染hTβ4鉴定

4.7转染hTβ4基因的hADSCs Western Blot检测

5讨论

转染hTβ4的hADSCs复合羊ADM对创面愈合影响的鉴定

1 引言

2实验材料与溶液配制

2.1实验材料

2.2主要仪器与设备

2.3主要实验试剂和耗材

3 实验方法

3.1羊ADM制备

3.2羊ADM细胞毒性的检测

3.3羊ADM分别与hADSCs和hTβ4-hADSCs复合

3.4裸小鼠植皮实验

3.5裸小鼠创面组织提取

3.5.1裸小鼠创面组织RNA提取

3.5.2裸小鼠创面组织HE染色

3.6组织蛋白提取

4 结果

4.1羊ADM制备

4.2羊ADM细胞毒性的检测

4.3羊ADM分别与hADSCs和hTβ4-hADSCs复合

4.4裸小鼠植皮实验

4.5创面愈合率计算

4.6 裸小鼠创面组织HE染色及新生血管组织观察

4.7裸小鼠创面愈合相关基因检测

4.8裸小鼠创面愈合相关蛋白检测

5 讨论

结 论

参考文献