Protein Regulating Cytokinesis1在小鼠卵子减数分裂成熟及着床前胚胎发育中的功能研究

摘要

胞质分裂调控蛋白1（Protein Regulating Cytokinesis1,PRC1）是微管结合蛋白家族中的重要成员之一，是细胞周期依赖性激酶的底物。在先前针对有丝分裂中的研究发现PRC1对纺锤体组装、细胞增殖、胞质分裂等过程具有重要的调控作用。但迄今为止，关于PRC1在哺乳动物卵子减数分裂成熟及着床前胚胎发育过程中的功能鲜有报道。在卵子成熟过程中染色体精确配对分离和胞质不对称分裂是胚胎正常发育的先决条件。纺锤体是卵子减数分裂过程中的动态结构，其正确的组装和迁移保证了染色体分离和胞质不对称分裂的正常进行。单倍体卵子受精后形成二倍体胚胎，经过连续多次的卵裂形成囊胚，然后在子宫着床发育。着床前胚胎正常的卵裂与发育是健康胎儿出生的前提。因此，在本论文中首次系统地探究了PRC1在小鼠卵子减数分裂成熟及着床前胚胎发育过程中的功能与作用机制。
　　研究目的：
　　研究PRC1在小鼠卵子减数分裂成熟和着床前胚胎中的功能及作用机制，为临床筛查异倍性卵子、预防出生缺陷提供依据。
　　研究方法：
　　（1）收集卵子成熟过程中的GV期、GVBD期、MI期、AI-TI期以及MII期卵子，利用蛋白质免疫印迹及免疫荧光染色激光共聚焦扫描技术分析PRC1的蛋白表达及亚细胞定位情况。收集受精后着床前胚胎发育过程中的AII-TII期、PN期、1-细胞分裂期、2-细胞期、4-细胞期、桑椹胚期以及囊胚期胚胎，利用免疫荧光染色激光共聚焦扫描技术对PRC1进行定位分析。
　　（2）使用特异性干扰纺锤体微管组装的药物紫杉醇（Taxol）和诺考达唑（Nocodazole）处理MII期卵子，通过免疫荧光染色激光共聚焦扫描技术检测PRC1与纺锤体微管的定位变化情况。进一步分析PRC1与微管的空间位置关系。
　　（3）对于PRC1在卵子中的功能研究，主要采用蛋白功能敲减技术。卵胞质显微注射特异性的Prc1Morpholino（MO），敲减PRC1蛋白后统计卵子减数分裂成熟中的GVBD比率；第一极体（Polar body1,PB1）的排放比率，并测量PB1的体积；利用免疫荧光染色激光共聚焦扫描技术检测纺锤体组装与染色体排列情况及纺锤体两极的稳定性；染色体铺片统计染色体异倍性概率；免疫荧光染色检测纺锤体区域动粒微管与动粒间的捕捉情况。
　　（4）卵胞质显微注射Prc1MO和GFP-Tubulin、mCherry-H2B荧光蛋白的mRNA，实时观察敲减PRC1后的纺锤体迁移过程，并测量迁移距离；免疫荧光染色检测纺锤体区域桥梁微管的组装情况；使用鬼笔环肽探针对微丝蛋白（F-Actin）进行标记，检测F-Actin的分布情况。
　　（5）卵胞质显微注射体外转录的外源Prc1mRNA，过表达PRC1后统计卵子减数分裂成熟中的GVBD比率；PB1的排放比率，并测量PB1的体积；显微注射GFP-Tubulin及mCherry-H2B荧光蛋白的mRNA，实时观察过表达PRC1后纺锤体组装与染色体聚集分离情况；染色体铺片统计染色体异倍性概率。
　　（6）为研究PRC1在着床前胚胎中的功能，在受精卵启动第一次有丝分裂之前的PN期阶段进行胞质显微注射Prc1MO，然后在24h、48h、72h、96h分别统计2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、桑椹胚以及囊胚的发育率；通过免疫荧光染色激光共聚焦扫描技术统计72h胚胎的细胞数目。
　　（7）为进一步探究PRC1在胚胎基因组激活后对胚胎发育的影响，选择2-cell期胚胎采用“双卵裂球对照敲减技术”开展实验研究。通过胞质显微注射的方式分别向两个卵裂球注射连有红色荧光基团的Ctrl MO-Lissa和绿色荧光基团的Prc1MO-Carboxy，通过荧光拍摄观察卵裂球分裂情况；采用免疫荧光染色激光共聚焦扫描技术检测两个卵裂的球纺锤体组装和染色体排列情况；通过显微注射GFP-Tubulin与mCherry-H2B荧光蛋白的mRNA检测不同卵裂球在PRC1敲减后的纺锤体组装与染色体聚集分离情况。
　　研究结果：
　　（1）蛋白质免疫印迹结果显示：在卵子减数分裂的GV和GVBD期，PRC1表达量较少；进入分裂期后，PRC1蛋白表达量显著上升。免疫荧光结果显示，PRC1在卵子与胚胎中的亚细胞定位具有相似性，主要分为三种模式：当卵子或胚胎核膜保持完整时，PRC1主要分布在细胞核中；当核膜破裂后，PRC1集中分布在胞质中；当细胞进入分裂期，PRC1大量聚集在纺锤体中央区，与中央纺锤体共定位。
　　（2）通过Taxol抑制微管的解聚，发现PRC1异常聚集；通过Nocodazole加速微管的解聚，发现PRC1定位消失。进一步证实PRC1与中央纺锤体微管存在共定位关系。
　　（3）卵子中PRC1的敲减不影响GVBD进程，但显著影响PB1的排放比率（51.4±3.0%），说明PRC1不参与卵子减数分裂恢复的起始阶段，但参与调控减数分裂起始后的进程。PRC1的敲减导致PB1的体积增加，并导致纺锤体组装异常（纺锤体成球期阻滞24.4±1.6%；筒状纺锤体36.1±2.5%）。纺锤体两极稳定性降低，纺锤体两极异常率增至87.2±2.5%，染色体异倍性概率增加（78.7±4.4%）。动粒微管不能精准捕捉动粒，异常概率高达78.6±4.5%。
　　（4）PRC1敲减后桥梁微管发生解聚，纺锤体迁移受阻，皮质区F-Actin的分布出现异常，最终导致卵子发生近似对称分裂。
　　（5）通过过表达实验反向验证PRC1的功能。结果显示过表达PRC1后同样不影响卵子GVBD过程，但显著降低PB1的排放比率（42.4±3.0%）。纺锤体组装与染色体排列异常，染色体异倍性概率显著增加（67.6±4.2%）。
　　（6）PN期敲减PRC1后不影响2-细胞率（90.6±1.7%），但显著降低4-细胞（52.0±8.8%），桑椹胚（31.5±4.7%）以及囊胚（13.7±3.2%）的发育率。PRC1的缺失会导致胚胎细胞分裂失败，胚胎细胞数量减少。
　　（7）2-细胞胚胎双卵裂球对照注射结果显示，PRC1的敲减导致卵裂球的胞质分裂失败，纺锤体组装与染色体排列均出现异常。
　　研究结论：
　　（1）PRC1蛋白表达及其亚细胞定位与小鼠卵子减数分裂及着床前胚胎的发育进程高度相关。
　　（2）卵子中PRC1通过参与纺锤体桥梁微管的组装来维持纺锤体的完整性及稳定性，促使动粒微管准确捕捉动粒，完成染色体的精准分离。
　　（3）卵子中PRC1通过参与纺锤体桥梁微管的组装以及影响皮质区微丝蛋白的分布，进而调控纺锤体迁移过程，最终促使卵子发生胞质不对称分裂。
　　（4）在着床前胚胎中，PRC1主要通过调控纺锤体与染色体复合体的动力学变化过程，调控胚胎胞质分裂过程。

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