鼠慢性左室肥厚及心衰时细胞信号传导、细胞骨架及膜电流改变

摘要

目的: 尽管心肌肥大是心脏在一些生理和病理情况下为维持足够的心脏收缩功能而采取的一种代偿性的适应性反应，但其心肌增殖肥大的最终结果往往导致心衰，而后者明显降低患者的生活质量和增加死亡率。MAPK(丝分裂素激活蛋白激酶)、JAK/STAT(Janse激酶/信号转导子和转录激活子)通路是重要的细胞信号调节通路系列，涉及细胞增殖、生长、分化、运动、衰老和死亡等细胞程序，一些体内外试验也显示了肥大心肌细胞中上述两个系列通路的激活。细胞膜钾电流是主要的动作电位复极电流，其变化对心肌细胞的兴奋性和收缩性有很大影响。细胞微管蛋白是主要的细胞骨架成份，在固定细胞器，转导细胞信息的方面起重要作用，但同时决定细胞的粘滞性和僵硬度，后两者对心肌细胞内肌丝的滑动又很大影响。目前对心肌细胞肥大的发生机制研究较多，但对心脏从代偿性肥大到心衰转变机制的研究尚不充分，且结果也有一定的差异性。该实验利用慢性升主动脉缩窄所致心肌肥大及心衰动物模型，研究细胞信号调节激酶(ERK)通路、JAK/STAT通路及心肌内微管蛋白β-tubulin、心肌细胞膜瞬时外向钾电流(Ito)、延迟整流性钾电流(IK)及其肾上腺素受体激动剂对二者的调控等在心肌肥大及向心衰转变过程中的变化，为今后更深入地研究心衰的发生发展机制并产生有效的干预治疗提供实验基础。 材料和方法: 1.升主动脉缩窄动物模型的建立及动物分组：3～4周龄、体重为80～100g的雌性wistar大鼠，戊巴比妥钠腹腔麻醉，上小动物呼吸机，开胸，剥离升主动脉，主动脉根上方用丝线穿无菌聚乙烯塑料管(直径1mm，长度6～7mm)环扎，负压关胸。将16周升主动脉缩窄组大鼠定为代偿性肥厚组，32周升主动脉缩窄组大鼠定为失代偿性心衰组；各缩窄对照组为同期开胸分离升主动脉不缩窄组。 2.心脏超声心动图学监测：大鼠术后行心脏超声心动图监测，用HP5500型超声诊断仪，探头频率2～4MHz。胸前放置水囊，取胸骨旁左室长轴和短轴切面。由二维超声引导M型曲线并进行测量。超声测定指标：1)左室后壁和室间隔舒张末期厚度(PWD、IVS)；2)左室舒、缩末内径(LVDD、LVSD)；左室射血分数(EF％)。 3.蛋白质印迹法测ERKs、JAKs、STATs、SOCSs、βTubulin表达水平：术后16周、32周时，各组大鼠分别行心脏超声检测结束后，称体重，迅速取心脏，PBS冰浴清洗，留取左室部分，称重后立即液氮冷冻，-80℃保存。留存各组大鼠的肺组织，称重。将心肌组织剪碎，加入细胞裂解液，冰浴下匀浆、10,000g离心，留上清，调蛋白质浓度为2mg/ml，用于ERKs、JAKs等信号蛋白质的定量。将心肌组织剪碎，加入微管稳定液匀浆，100,000g离心，上清为游离β-tubulin成分，留置；沉淀重新悬浮在微管解聚液中1h，100,000g离心，上清为聚合β-tubulin，留置。取等量上述蛋白质溶液，12％SDS-PAGE电泳、转膜，封闭，分别加入1：200～500稀释的一抗(兔抗ERK1/2或小鼠抗p-ERK1/2多克隆抗体，抗JAK1、JAK2、STAT1、STAT3多克隆抗体、抗pTyr(1022/1023)-JAK1、抗pTyr(1007/1008)-JAK2、抗pTyr(701)-STAT1和抗pTyr(704)-STAT3、抗SOCS1、抗SOCS3、小鼠抗β-tubulin多克隆抗体)杂交过夜。封闭漂洗后加入1：5000稀释的二抗(HRP标记的羊抗兔IgG抗体)，化学发光增强，X光压片曝光，漂洗后自显影。用密度扫描仪测定条带的密度(OD值)，以积分光密度代表各种蛋白的相对表达值。 4.心肌细胞的分离：各实验组大鼠麻醉称重后，开胸取心脏，称重，主动脉逆行插管，改良Langendorff管灌流。先用台氏液冲洗，再用无钙台氏液使心脏停跳，然后用含胶原酶的无钙台氏液灌流，KB液冲洗残留的酶液，留用左室游离壁中层心肌组织并剪碎，搅拌后筛网过滤，离心清洗，KB液中留存，杆状、有清晰横纹的心肌细胞用于膜电流测定。 5.膜片钳全细胞记录技术：利用全细胞膜片钳制技术记录钾电流，使用膜片钳放大器。尖端膜片电极对心肌细胞进行千兆封接。全细胞状态形成后，用pCLAMP5.5.1软件程序发放刺激并收集记录信号。电流记录采用电压钳制式。所有钾电流密度经膜电容标准化处理后进行比较，每一钳制电压下的电流强度绘制成电流电压曲线。 6.统计学分析：所有数据采用SPSS10.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示，采用成对t检验和单因素方差分析方法。 结果: 1.心脏超声心动学检测：16周缩窄组大鼠与对照组相比较，PWD、IVS明显增厚。LVDD、LVSD、SV及EF％无明显变化。32周缩窄组大鼠与对照组及16周缩窄组大鼠比较，LVDD、LVSD明显增加，EF％明显降低，PWD、IVS较正常对照组增厚，但较16周缩窄组大鼠无明显变化。提示，16周缩窄组大鼠出现心肌肥厚，但心功能正常；32周缩窄组大鼠在心肌肥大的基础上出现心腔扩大、心功能降低。 2.各组大鼠尸检参数：16周缩窄组大鼠心重/体重比值明显高于对照组，肺重/体重比值无变化。32周缩窄组大鼠心重/体重比值明显高于对照组及16周缩窄组，肺重/体重比值较对照组及术后16周大鼠明显增加。提示，16周缩窄组大鼠出现心肌肥大，但心功能正常；32周缩窄组在心肌肥大的基础上又出现左心衰竭。 3.各组大鼠心肌组织蛋白印迹检验结果 3.1 各组大鼠左室肌ERK、p-ERK1/2的表达：16、32周缩窄组大鼠与相应对照组比较，ERK1、ERK2、p-ERK1、p-ERK2表达量均明显增高。32周缩窄组大鼠与16周缩窄组大鼠比较，ERK1、ERK2的表达无明显变化，但p-ERK1、p-ERK2明显降低。p-ERK与心肌肥大的程度(心重/体重比值)呈正相关。 3.2 JAK/STAT及SOCS的表达及活性：16周缩窄组大鼠与对照组相比，JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、SOCS3的蛋白表达量均不同程度的增加，但SOCS1无明显变化。32周缩窄组大鼠与对照组相比，JAK1、p-STAT1无明显变化，而p-JAK1、p-STAT3明显降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT3、SOCS1、SOCS3明显增加。32周缩窄组大鼠与16周缩窄组比较，JAK2、STAT1、SOCS3无明显变化，JAK1、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1、STAT3、p-STAT3明显降低，SOCS1明显升高。 3.3 β-tubulin的蛋白表达：16、32周缩窄组大鼠与相应对照组比较，游离型及聚合β-tubulin均明显升高，但聚合型升高比例明显高于游离型，聚合型与游离型β-tubulin表达量之比明显增高，且上述变化在32周缩窄组更显著。聚合型β-tubulin的蛋白表达量与大鼠心重/体重比值及肺重/体重比值呈正相关，与心脏左室射血分数呈负相关。 4.各组大鼠Ito及IK密度变化及肾上腺素受体激动剂对二者的影响：各组大鼠心肌细胞Ito、IK激活电压均在-40mV，电流密度-电压(Ⅰ-Ⅴ)均呈线性关系。16、32周缩窄组大鼠与相应对照组比较，Ito、IK密度均明显降低，在32周缩窄组大鼠，Ito降低更明显。32周缩窄组大鼠与16周缩窄组大鼠相比较，Ito密度又有所降低，IK密度无明显差别。苯福林、异丙肾上腺素均能使正常及16周缩窄组大鼠Ito、IK电流密度降低，且呈浓度依赖性，但苯福林对16周缩窄组大鼠IK降低的程度及异丙肾上腺素对16周缩窄组大鼠Ito降低的程度要明显低于正常心肌细胞。苯福林、异丙肾上腺素对32周缩窄组大鼠的Ito及IK均无明显影响。 结论: 1.在代偿性心肌肥大阶段，心肌细胞信号传导MAPK通路中的总ERK1/2蛋白合成量及其活化程度均明显增加；在心衰期，ERK1/2活化程度较代偿性心脏肥大阶段明显下降。 2.在代偿性心脏肥大阶段，JAK/STAT通路中的总JAKs、STATs蛋白合成量及其磷酸化状态、内源性抑制因子SCOS3较正常均明显增高；在心衰期，JAKs、STATs的磷酸化状态较代偿性心脏肥大期明显下降，SCOS1明显增加。 3.微管蛋白β-tubulin游离及聚合型的蛋白表达量在代偿性心脏肥大阶段均明显升高；在心功能失代偿期，降低的心脏功能与明显增加的聚合型β-tubulin表达量有关。 4.在代偿性心脏肥大阶段，细胞膜外向钾电流Ito及IK电流密度均出现降低；在心功能失代偿期，Ito密度降低更显著，且心衰心肌细胞膜肾上腺素受体对其受体激动剂的敏感性明显降低。

目录

英文缩略语

前言

论文一慢性升主动脉缩窄致心肌肥厚及心衰大鼠左心室肌细胞外信号调节激酶(ERK)的变化

实验材料与方法

结果

讨论

结论

论文二慢性压力负荷所致心肌肥厚及心衰大鼠左心室肌JAK/STAT的变化

实验材料与方法

结果

讨论

结论

论文三升主动脉缩窄所致心肌肥厚及心衰大鼠左心室肌微管蛋白β-Tubulin的动态变化

实验材料与方法

结果

讨论

结论

论文四心肌肥厚及心衰大鼠左室心肌细胞外向钾电流（Ito、Ik）的变化及肾上腺素能对其的调控

实验材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新点

参考文献

致谢

综述细胞因子信号的反向调节因子SCOS

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