紫杉醇诱导膀胱癌细胞凋亡和抑制膀胱肿瘤生长的实验研究

摘要

膀胱癌的新诊病例中70％为浅表性膀胱癌，浅表性膀胱癌的首选治疗为经尿道切除。膀胱癌经尿道切除后仍有较高的复发率和进展率。膀胱灌注治疗可以杀死残留的肿瘤细胞、降低复发率、延长复发间隔，也可能防止肿瘤进展，是浅表性膀胱癌经尿道切除术后的常规辅助治疗。 目前紫杉醇已是国际上继阿霉素和含铂类抗癌药物之后的热点抗肿瘤薪药。美国FDA已批准紫杉醇用于转移性卵巢癌和乳腺癌等的治疗。紫杉醇是一种作用于有丝分裂纺锤体的药物，阻滞真核细胞于G<,2>/M期。低浓度时通过改变微管动力学变化，限制细胞有丝分裂，引起细胞体积和DNA含量异常，造成细胞死亡；高浓度时造成稳定的微管束形成，增加了微管聚合体团块体积，导致G<,2>/M期阻滞和细胞凋亡。紫杉醇对膀胱肿瘤具有显著的疗效，为目前所知膀胱肿瘤单药化疗之最，已进入临床Ⅱ、Ⅲ期临床试验。在评价紫杉醇的抗肿瘤作用中，凋亡是重要的指标和机制之一。 MNU诱导的膀胱肿瘤与人膀胱肿瘤的发生和生物学行为类似，经历从原位癌、肌层浸润和死亡的全过程，而且发现多种治疗药物对其诱导的晚期肿瘤无效，对早期肿瘤则效果明显，这也符合临床膀胱肿瘤治疗的普遍情况。因此，可以用该模型进行膀胱肿瘤化疗的研究。 本实验以人膀胱癌EJ细胞株为靶细胞，观察不同浓度紫杉醇作用后EJ细胞的形态学改变，以及紫杉醇诱导EJ细胞凋亡及抑制增殖的作用，并探讨其作用的时间、剂量一效应关系，分析紫杉醇诱导膀胱癌细胞凋亡的机制，为紫杉醇用于膀胱癌的治疗提供理论依据。因为紫杉醇可能通过药理作用，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，本研究用紫杉醇对MNU诱导的大鼠膀胱肿瘤模型进行膀胱灌注，并以细胞增殖周期比例、微血管密度和凋亡指数为指标对紫杉醇的抑瘤作用机制进行探讨。体外培养人膀胱癌EJ细胞，以1、10、100、1000nmol/L紫杉醇处理12～72h后，应用MTT比色法测定不同浓度紫杉醇对EJ细胞增殖的影响，并绘制剂量一效应曲线；通过电镜观察检测细胞凋亡；采用PI单染法用流式细胞仪检测膀胱癌EJ细胞的凋亡率，测定细胞周期。 雌性Wistar大鼠100只，100～12周龄，体重240±20克，随机分成A、B、C、D和E共5组，每组20只。A组，膀胱灌注枸橼酸缓冲液O．2mL，每2周一次，共4次，于第一次灌注后第8周行生理盐水O.5mL膀胱灌注每周1次共6次；B、C、D和E组大鼠膀胱灌注MNU溶液0.2mL，每2周一次，共4次，诱导膀胱癌。B、C、D和E组于第一次灌注后第8周分别行生理盐水、鱼软骨多糖溶液、草分枝杆菌制剂和紫杉醇二甲亚砜溶液O.5mL膀胱灌注，每周1次共6次。于最后1次灌注后24小时以膀胱绝对重量与体重的比值(膀胱相对重量)作为膀胱肿瘤的生长参数进入统计分析。并于第8、14周每组随机抽取2只大鼠，病理学检查。 B和E组膀胱标本病变明显处取材，置人10％中性福尔马林溶液中固定，制作石蜡包埋标本，应用免疫组织化学SABC法以CD34标记血管内皮测定微血管密度。其余肿瘤组织制成单细胞悬液以Annexin V细胞凋亡检测试剂盒，流式细胞仪检测凋亡细胞比率；另吸取单细胞悬液，流式细胞仪检测细胞周期。 结果： 紫杉醇能抑制EJ细胞的生长，并在一定剂量和时间范围内呈现出时间、剂量依赖关系。电镜下凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成新月形。流式细胞仪检测观察到细胞周期阻滞于G<,2>/M期，高浓度(100、1000nmol/L)明显出现凋亡峰，细胞的凋亡率随紫杉醇浓度的增大而增加。 大鼠膀胱灌注MNU溶液后第8周时，B、C、D和E组均发生病变。粘膜上皮增生可达10层，可见非典型增生和出现移行细胞癌I级。14周时，可见明显膀胱肿瘤，肿瘤细胞浸润可达肌层，肿瘤细胞异型明显，有的表现为癌细胞高度未分化，移行上皮结构特征完全消失，呈弥漫分布或排列成实体性癌巢。第14周B组大鼠膀胱重量大于A组；C、D和E等3个用药组膀胱重量均小于B组，其中E组膀胱重量与B组比较有统计学意义。E组G<,2>/M期的肿瘤细胞多于B组，而S期肿瘤细胞少于B组；E组肿瘤细胞的凋亡率高于B组，而微血管密度低于B组。 紫杉醇能抑制膀胱癌EJ细胞的生长，在一定剂量范围内呈时间浓度依赖性；紫杉醇能够诱导EJ细胞凋亡，细胞凋亡率随紫杉醇浓度的增大而增加。 MNU诱导的膀胱肿瘤模型与人膀胱肿瘤的发生和生物学行为类似，其早期肿瘤适合评价药物对膀胱癌的治疗作用。草分枝杆菌制剂和(鱼,工)鱼软骨多糖连续膀胱灌注未表现出对膀胱肿瘤明显的抑制作用，而紫杉醇二甲亚砜溶液则显示出强大的抑制膀胱肿瘤生长的作用。紫杉醇灌注使膀胱肿瘤G<,2>/M期细胞增多，诱导大鼠膀胱肿瘤细胞凋亡，抑制了大鼠膀胱肿瘤的新血管的生成。本研究认为紫杉醇膀胱灌注抑制大鼠膀胱肿瘤生长的机制与诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新血管生成有关。

目录

中国医科大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

中文论著摘要

英文论著摘要

英文缩略语

论文一紫杉醇诱导膀胱癌EJ细胞株凋亡的实验研究

论文二紫杉醇、草分枝杆菌制剂和魟鱼软骨多糖灌注干预大鼠膀胱癌生长的初步研究

论文三紫杉醇抑制大鼠膀胱肿瘤生长的机制

参考文献

综述浅表性膀胱癌的灌注疗法

在学期间科研成绩

致谢

个人简介