玻璃微流控芯片表面处理及其在DNA分析中的应用

摘要

微型全分析系统(MiniaturizedTotalAnalysisSystems，μTAS)是当前世界上最前沿的科技领域之一，其目的是通过化学分析设备的微型化和集成化，最大限度地把分析实验室的功能集成到便携的分析设备中，甚至是方寸大小的芯片上，即“Labonachip”。微流控芯片是μTAS当前最活跃的研究领域，以微通道网络及众多分析功能元件的集成化为其结构特征，不仅使试样和试剂的消耗显著下降，而且具有高效、高速、高通量的分离分析能力。 生物医学是当前微流控芯片的主要应用领域。芯片毛细管电泳是以微流控芯片上的微通道作为分离通道的分离分析技术。因微通道比表面积显著增大，焦耳热能很快向四周溢散，所以可施加平板凝胶电泳难以达到的高场强，从而实现对样品的快速、高效的分离检测。 微流控芯片的微米级结构显著增大了微通道的比表面积，所以保持其内表面的物理化学性质的平衡、稳定具有十分重要的意义。 玻璃具备优良的光学性能，且易于进行表面改性，是最广泛使用的芯片基材之一。玻璃微流控芯片在进行电泳分析时，因微通道内表面-SiOH基团上的H+解离，当在微通道两端施加外电场时，通道内整个缓冲溶液会流向阴极，形成电渗流(ElectroosmoticFlow，EOF)。EOF不仅导致微通道表面对DNA样品的吸附而且严重影响玻璃芯片对DNA样品的分离效能，所以有效抑制EOF是玻璃芯片获得高分离效率的前提。 对芯片微通道进行表面改性处理是一种控制EOF的常用方法，可分为动态涂层和永久表面改性。前者是最简单的表面改性方法，改性化合物可通过物理吸附结合在微通道表面实现动态涂层。但因表面涂层不能长期保持稳定状态，其应用受到限制。后者是控制EOF和减少样品—表面吸附的最有效的方法。硅烷化试剂常用于永久改性处理中，其与微通道表面—SiOH基团可共价键合，也可进一步将线性聚合物交联固定在通道表面形成涂层以屏蔽-SiOH基团，从而有效抑制EOF和通道表面对DNA样品的吸附，提高芯片电泳的分离效能。但硅烷化试剂与-SiOH基团形成的共价键在偏碱性条件下可能会分解，使经过硅烷化处理的芯片在使用碱性电泳筛分介质时分离效能下降。 本研究提出了一种针对玻璃芯片微通道新的表面处理方法，即将硅烷化与静置动态涂层处理相结合对微通道进行表面改性，探讨了其对芯片分离效能的影响。通过检测芯片对ФX174-HaeⅢRFDNA标准样品和PCR产物的分离效能，考察对微通道进行硅烷化结合静置动态涂层表面改性的效果。采用共聚焦型激光诱导荧光检测装置对荧光信号进行检测。为了验证这种表面改性方法的适用性，分别在YOYO-1、EB、TO-PRO-3三种荧光检测体系下，在经过表面改性的玻璃芯片上对DNA标准样品进行分离检测。 实验材料和方法利用标准光刻和湿法刻蚀技术在玻璃基片上刻蚀出十字形微通道网络，采用热键合方法将其与盖片进行封接，在微通道末端粘接储液池，制成玻璃微流控芯片。微通道表面改性包括三个处理过程：①将含有1.5％(W/V)的羟乙基纤维素(Hydroxyethylcellulose，HEC)的1×TBE缓冲溶液充入制作完成的芯片微通道中，芯片置于密闭容器中存放，即对微通道表面进行静置动态涂层处理。②使用硅烷化试剂对制作完成的芯片微通道表面进行硅烷化改性处理。③使用硅烷化试剂对玻璃芯片微通道进行改性处理之后，在微通道内充入含有1.5％(W/V)HEC的1×TBE缓冲溶液，芯片置于密闭容器中存放，即对微通道表面进行硅烷化与静置动态涂层结合处理。在倒置生物显微镜上搭建共聚焦型激光诱导荧光检测装置，采用半导体激光器作为激发光源，产生的荧光信号经光电倍增管收集后由记录仪记录。利用高压电源提供芯片微通道高电场，采用夹流进样方法进行DNA样品的进样和分离操作，并优化HEC浓度、电场强度电泳条件，在此条件下考察DNA标准样品中11个片段迁移时间的重现性。在该检测体系下对PCR产物(144bp)进行电泳分离检测。分别在YOYO-1、EB、TO-PRO-3三种荧光标记体系下考察该表面处理方法的适用性。 实验结果未经任何表面处理的玻璃芯片在对DNA标准样品进行电泳分离时，未检测到任何DNA片段的出峰信号。对微通道进行静置动态涂层处理72h后，可检测到DNA标准样品峰信号，但芯片不能对DNA片段进行有效分离。 对玻璃芯片微通道进行硅烷化处理后，在电泳分离时出现DNA标准样品的检测信号，可检测到DNA标准样品全部11个片段中的9个片段，但对271/281bp片段、1078/1353bp片段不能进行有效分离。 对芯片微通道进行硅烷化结合静置动态涂层表面改性处理后，玻璃芯片的分离效能得到提高，DNA标准样品中全部11个片段均可被分离检测，对271/281bp、1078/1353bp片段实现有效分离。 对芯片电泳条件进行优化，选择筛分介质HEC浓度为1.5％(W/V)、电场强度为100V/cm。在此条件下对ФX174-HaeⅢRFDNA标准样品中11个片段的电泳迁移时间进行重现性考察，11个DNA片段迁移时间RSD均小于1.2％，表明经过硅烷化结合静置动态涂层处理后的微通道具有稳定的表面性质，能良好地重现对DNA片段的分离检测。在该检测体系下，对PCR产物(144bp)进行了快速、准确的分离检测。 在YOYO-1、EB、TO-PRO-3三种荧光标记体系下均能实现对DNA标准样品中全部11个片段的分离检测，表明该表面处理方法可适用于不同的DNA标记体系。 结论本研究提出了一种新的玻璃芯片微通道表面处理方法，在构建的微流控芯片DNA分析系统上实现了对DNA标准样品和PCR产物的高重现性的电泳分离检测，该方法有望在突变筛查、临床诊断、药物分析中广泛应用。

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实验结果

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结 论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综 述电脉技术在基因突变检测中的应用

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