马蹄内翻足模型胎鼠脊髓组织蛋白质组学及相关基因分析

摘要

目的先天性马蹄内翻足(congenitaltalipesequinovarus，CTEV；congenitalclubfoot，CCF)是一种儿童常见的严重影响足功能的先天畸形，发病率约为0.064～0.8％，男女之比约为2.0～2.5∶1，在活产胎儿中发生率约为1‰，双侧同时发病占50％，右足多于左足。主要畸形包括前足内收、踝跖屈、跟骨内翻以及继发性胫骨远端内旋。畸形不影响患儿生存和生育，但严重影响其生活质量。病因目前还不清楚，有多种学说，如：神经肌肉病变，血管发育异常，骨骼发育异常，软组织异常，遗传基因学说以及宫内发育阻滞学说等。部分学者在某一领域达成共识，如：神经肌肉病变学说，但尚无定论。遗传流行病学研究表明，遗传因素是马蹄内翻足发病主要原因之一。 蛋白质广泛参与细胞的功能及调节，蛋白质组决定细胞乃至组织和器官的表型。不论是处于正常状态还是急慢性疾病状态，表型都是多种多样的。蛋白质组学是一个新兴的研究领域，其核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析，通过对某物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质(包括表达水平、结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用等)的研究，对蛋白质所执行的生理性、病理性生命活动做出最精细、最准确、最本质的阐述。表达蛋白质组学是现今应用最为广泛的蛋白质组学研究模式。该策略的技术路线主要是通过双向凝胶电泳建立蛋白质组图谱、用专业图像扫描分析软件进行图像分析、通过质谱及蛋白质数据信息处理技术进行蛋白质的鉴定与分析。 本实验在全反式维甲酸(alltrans-retinoicacid，ATRA)诱导大鼠动物模型的基础上，采用双向电泳的方法对脊髓组织蛋白质组进行分离，通过软件分析和质谱-生物信息学方法寻找疾病相关蛋白质，通过该蛋白质进一步寻找马蹄内翻足疾病相关基因。 前期通过对胎鼠胫骨后肌组织的蛋白质组学的实验分析，发现慢骨骼肌肌钙蛋白T(slowskeletalmuscletroponinT，sTnT；troponinT，slowskele-talmuscle，TnTs)在模型胎鼠中未见表达，本实验采用RT-PCR方法，进一步分析该蛋白的编码基因—Tnnt1—与马蹄内翻足疾病发生的关系。 方法1.建立马蹄内翻足大鼠胚胎模型 1.1将孕10d的Wistar大鼠随机分为对照组和实验组，按135mg/kg体重用灌胃法给予实验组大鼠ATRA，对照组给予相应体积矿物油。 1.2孕21d剖腹取出胚胎，分离脊髓、踝部骨骼(下肢踝关节上2mm至足正中，去除肌肉、皮肤组织)及踝部肌肉(下肢踝关节上2mm至足正中，去除骨骼、皮肤组织)。 2.模型胎鼠与对照胎鼠脊髓组织蛋白质组差异分析 2.1提取胎鼠脊髓组织的总蛋白质，Bradford法进行蛋白定量。 2.2等电聚焦使用PROTEANIEF等电聚焦仪。聚焦后的胶条经两步平衡后进行SDS-PAGE电泳，染色、扫描后用PDQuest7.1.0进行图像分析，寻找差异蛋白点。 2.3切取差异点并进行质谱和生物信息学分析。 3.Tnnt1在模型胎鼠和对照胎鼠中表达情况分析 3.1用TRIzol试剂分别提取模型胎鼠和对照胎鼠的脊髓、踝部骨骼和踝部肌肉的总mRNA。 3.2用RT-PCR方法检测该基因在三种组织中的表达情况，进一步分析Tnnt1与马蹄内翻足畸形的相关性。 结果1.成功重复构建了马蹄内翻足样畸形大鼠模型 孕21d剖检共获取胎鼠344只，其中对照组112只，实验组232只。对照组CCF样畸形发生率为零；实验组CCF样畸形发生率为80.98％，其中单纯CCF发生率达29.27％。 2.模型胎鼠和对照胎鼠脊髓组织双向电泳图谱差异分析结果 使用宽pH(pH3-10)胶条和窄pH(pH5-8)胶条所获图谱均显示多数蛋白质点匹配良好。在两种图谱中：模型胎鼠中分别有13～15和8～10个蛋白点明显上调，15～17和10～12个蛋白点明显下调，有9～11和11～13个蛋白点仅在对照胎鼠中表达，7～9和10～13个蛋白点仅在模型胎鼠中表达。 3.模型胎鼠和对照胎鼠脊髓组织蛋白质组分析结果 选取界限清楚、重复性好的6个差异蛋白点进行质谱鉴定。6个点的质谱结果均为阳性。经生物信息学数据库检索后，检索结果阴性者1个，检索结果阳性者5个(其中2个点的数据库查询结果一致)，初步鉴定的结果分别为：烯醇酶(仅表达于对照胎鼠)、ATP合酶F1复合体组装因子2(仅表达于模型胎鼠)、微管蛋白β链(模型胎鼠下调5倍以上)和载脂蛋白A-Ⅰ(模型胎鼠上调5倍以上)。 4.Tnnt1基因在马蹄内翻足模型胎鼠中的表达 半定量RT-PCR分析结果表明，70.0％(21/30)的马蹄内翻足模型胎鼠踝部骨骼和76.7％(23/30)的踝部肌肉组织中Tnnt1表达下调，在脊髓组织中基本无表达。 结论1.首次应用双向电泳技术获得了重复性好的孕21d胎鼠脊髓组织蛋白质组双向电泳图谱。 2.首次分析了马蹄内翻足模型胎鼠与对照胎鼠脊髓组织蛋白质组差异，模型胎鼠的烯醇酶没有表达，微管蛋白表达下调，载脂蛋白表达上调，而ATP合酶F1复合体组装因子2仅在模型胎鼠中表达。 3.半定量RT-PCR分析结果表明Tnnt1表达下调可能是马蹄内翻足发生的原因之一。

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