抗Ⅳ型胶原抗体偶联金雀异黄素抑制后发障的研究

摘要

本文研究目的：制备抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物，检测偶联物抗体活性及药物的活性，评价其对人晶状体上皮细胞的抑制作用。为导向药物治疗在眼内应用提供理论依据。 研究方法： 第一部分：金雀异黄素抑制体外人晶状体上皮细胞增殖的研究。 1、细胞培养冻存的人晶状体上皮细胞复苏后，用含10％的胎牛血清100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及1.9g/LHEPES的DMEM培养基，37℃、5％CO<,2>的培养箱中培养，绘制细胞生长曲线。 2、MTT测定不同浓度组金雀异黄素不同时间对人晶状体上皮细胞增殖的抑制作用。 3、流式细胞仪检测不同浓度组金雀异黄素在24h、48h、72h对人晶状体上皮细胞周期及凋亡的影响。 4、逆转录聚合酶链反应检测不同浓度组金雀异黄素作用人晶状体上皮细胞48h后人晶状体上皮细胞内P21、P53、CyclinD1 mRNA表达情况。 5、免疫印迹(western blot)检测不同浓度组金雀异黄素作用人晶状体上皮细胞48h后人晶状体上皮细胞内P21、P53、CyclinD1蛋白表达情况。 第二部分：抗Ⅳ型胶原抗体一金雀异黄素偶联物制备提纯及检测。 1、抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素通过活性酯法偶联。 2、抗Ⅳ型胶原抗体．金雀异黄素偶联物的提纯及检测。 3、免疫组织化学实验检测偶联物中抗体活性。 第三部分：抗Ⅳ型胶原抗体一金雀异黄素偶联物体外抑制人晶状体上皮细胞增殖的研究。 1、倒置显微镜细胞形态学的观察，偶联物作用人晶状体上皮细胞，观察48h内细胞形态变化，并拍摄细胞生长情况。 2、丫啶橙染色观察细胞凋亡情况。 3、MTT法分析偶联物作用人晶状体上皮细胞12、24、48h对人晶状体上皮细胞增殖抑制作用。 研究结果： 1、绘制了人晶状体上皮细胞生长曲线，传代后3-5天为对数生长期。 2、不同浓度的金雀异黄素可抑制LECs增殖，在0-75mg/L范围内呈剂量效应关系，并随时间的延长，抑制效应增强。质量浓度为75 mg/L的金雀异黄素作用12 h对hLEC抑制作用与对照组差异有统计学意义(P=0.03)，作用24 h、48 h质量浓度为12.5、25、50、75 mg/L的金雀异黄素对LEC抑制作用与对照组有统计学差异(P<0.05)，72 h组各质量浓度的金雀异黄素对LEC抑制作用与对照组均有统计学差异(P<0.05)。 3、随Gen浓度的增大，G<,1>-S期细胞明显增多。金雀异黄素作用24 h诱导凋亡不明显；在48 h组，质量浓度为12.5 mg/L处理组出现凋亡峰，当质量浓度达到50.0 mg/L时凋亡明显；处理72 h，6.25 mg/L质量浓度组即可诱导凋亡，25mg/L质量浓度组凋亡达51.83％，50 mg/L质量浓度组凋亡达59.3％。 4、RT-PCR检测结果显示，随Gen浓度逐渐增高，晶状体上皮细胞P21mRNA的表达逐渐下调，而CyclinD<,1>的mRNA表达水平上调，而对照组及不同浓度Gen处理组p53的mRNA均有表达，处理组与对照组间有统计学差异，但各处理组间无统计学差异。 5、Western blot法检测结果：随Gen作用浓度增加P21蛋白表达逐渐减少，CyclinD<,1>蛋白表达水平逐渐增高，P53蛋白表达处理组与对照组之间表达有显著差异(P<0.05)，但各处理组间无显著差异。 6、抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素通过活性酯法成功偶联，本研究偶联产物中抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素克分子比为1∶439，偶联物与晶状体囊膜可特异结合。 7、丫啶橙染色观察经偶联物作用24h、48h后的细胞均发生凋亡的形态学改变。 8、偶联物作用人晶状体上皮细胞12、24、48h对人晶状体上皮细胞增殖均有抑制作用，抑制率分别为28.5％、50.3％和76.9％。 研究结论： 1、金雀异黄素能够抑制人晶状体上皮细胞的增殖，这种抑制是通过细胞周期阻滞和细胞凋亡共同作用的结果。 2、采用活性酯法可成功地将抗Ⅳ型胶原抗体与金雀异黄素偶联，偶联物的免疫活性良好。 3、抗Ⅳ型胶原抗体．金雀异黄素偶联物体外具有高效的抑制晶状体上皮细胞增殖的作用。

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论文一金雀异黄素抑制体外人晶状体上皮细胞增殖的研究

前言

实验方法

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讨论

结论

论文二抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物制备提纯及检测

前言

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论文三抗Ⅳ型胶原抗体-金雀异黄素偶联物抑制体外人晶状体上皮细胞增殖的研究

前言

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结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述细胞外基质与后发障

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